[ＲＮＡ干扰ＶＥＧＦ对体外ＪＡＲ细胞生长的影响]小干扰后什么时候收细胞

　　摘 要：利用pSUPER质粒作为载体，在人绒癌JAR细胞内成功的沉默了VEGF基因的表达，建立了稳定转染pSUPER-shVEGFl，pSUPER-shVEGF2干扰质粒的JAR细胞株．随后利用RT-PCR证实了在JAR细胞株中，VEGF基因的表达被抑制，显微观察及流式细胞学检测转染后细胞株克隆生长情况显示体外培养条件下VEGF基因受抑后JAR细胞生长周期无发生变化，提示VEGF在体外可能对JAR细胞增殖无直接作用。
　　关键词：RNA干扰；血管内皮生长因子；JAR细胞；pSUPER载体
　　中图分类号：R34
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2007)0l－0072-06
　　
　　血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor.VEGF)是一种作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，具有强有力的血管生成与新生作用，与肿瘤生长密切相关RNA干扰(RNAinterference.RNAi)是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double-strandedRNA.dsRNA)时特异性阻断该基因表达的现象，RNAi技术能使人类快速了解生物体内某基因的功能，同时它的基因特异阻断特性为基因治疗提供了有益的探索，本研究利用RNA干扰技术，抑制或沉默来自于绒癌滋养细胞JAR细胞株的VEGF的表达，研究体外VEGF对于JAR细胞生长的影响，旨在探讨VEGF在恶性肿瘤中的作用机制，为恶性肿瘤的病理机制及治疗提供线索．
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 主要材料
　　1.1.1 人绒癌JAR细胞株
　　购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，常规培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中。
　　1.1.2 主要试剂
　　逆转录试剂盒购自Promega公司；RPMI-1640培养基，pUC Mix marker为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；LipofectamineTM2000脂质体和Fugene6转染试剂购自Invitrogen公司MiniBESTPlasmid Purification Kit，HindⅢ、EcoR I限制性内切酶，Taq DNA聚合酶购自TaKaBa公司；大肠杆菌DH5α，JM109由中南大学肿瘤研究所惠赠；pMD18-T载体购自TaKaBa公司；pSUPER.retro质粒，即pSUPER逆转录病毒载体由OligoEngine公司生产，带有HI-RNA启动子序列。HindⅢ及EcoR I酶切位点，具有氨苄和嘌呤霉素抗性，如图1。
　　
　　
　　1.2 方法
　　1.2.1 VEGF寡核苷酸序列的设计
　　根据文献查询及实验目的，参照其他成功者的经验，上游引物应用5′端通用引物，携有HI启动子起始区及EcoR I酶切位点；为确保RNA干扰成功，下游引物设计两对VEGF特异性序列，分别称为Vla、Vlb及V2a、V2b，为19nt核苷酸的正向插入序列及反向互补序列，中间被9个碱基(100p区)分开，克隆后可组成短发夹结构，根据pSUPE.retro载体结构，下游引物携有HI启动子的末端区序列及HindⅢ酶切位点接头，中间插入BglⅡ的酶切位点；短发夹VEGF(short hair-pin VEGF，shVEGF)目的序列的5′端第一个碱基设计为G，启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔，以确保转录的发生．
　　1.2.2 RNA干扰质粒的构建
　　1.2.2.1 PCR
　　分别以Primer 1和Primer Vla及Primer 1和Primer V2a为上下游引物，以pSUPER．retro为模板进行第一轮PCR．将第一轮PCR产物稀释100倍，分别取1μL作为模板，再分别以Primer 1和Primer Vlb及Primer V2b为引物进行第二轮PCR.HI Promoter区218 bp，第一轮PCR产物252bp，第二轮PCR产物298 bp.PCR的反应体系：10 x reaction buffer 2μL，模板DNA 1μL，上游引物(10μmol/L)0.4μL，下游引物(10μmol/L)0.4μL，dNTPs(2mmol/L)0.4μL，Taq酶1U，加ddH2O至20μL．反应条件：94℃预变性30s、62℃退火30s、72℃延伸40 s，30个循环，72℃延伸10min，第一轮PCR产物扩增出HindⅢ酶切位点，H1启动子区域、BgtⅡ酶切位点、VEGF的正义链序列及loop区；第二轮PCR，扩增出具有H1启动子区域并带针对VEGF的发夹RNAi片段产物，且在它们之间有一个BglⅡ酶切位点，两端带有EcoR 1和HindⅢ酶切位点。
　　1.2.2.2 TA克隆
　　将上述经2％的琼脂糖验证的PCR产物用于以下连接．反应体系为：pMDl8-T载体1μL，PCR扩增的产物0.4μL，T4连接酶Bufer(10×)1μL，T4DNA连接酶(3u/μL)1μL，加ddH2O至20μL.22℃水浴连接1h，挑选阳性克隆，取1μLJMl09大肠杆菌菌液做PCR鉴定是否携带目标片段，将鉴定好的克隆和上下游引物一并送上海博亚生物技术公司AB1377型全自动测序仪测序．
　　1.2.2.3 质粒抽提与双酶切
　　按说明书抽提氨苄青霉素筛选后的JMl09大肠杆菌质粒，行双酶切．将pSUPER.retro质粒和TA克隆产物分别用EcoR I和HindⅢ双酶切，酶切体系分别为：10×Y+/TangTMBuffer 4μL，EcoR 1限制性内切酶1μL，HindⅢ限制性内切酶1μL，TA克隆产物或pSUPER空载体质粒DNA 8μL,加五蒸水至20 μL，37℃酶切反应3h，100℃水浴灭活限制性内切酶，分别取1μL行2％琼脂糖凝胶电泳(0.5×TEB，5V/cm)，琼脂糖凝胶电泳后，于紫外灯下仔细切取所需目的条带，放入一干净的2mL试管内，按说明书行胶回收。
　　1.2.2.4 连接反应
　　将已酶切的pSUPER.retro空载体质粒与TA克隆酶切后的目的片段进行定向连接，反应体系：pSUPER.retro酶切片断1μL，TA克隆酶切片段3μLT4连接酶Bufer(10×)5μL T4连接酶(3u/μL)1μL加双蒸水至20μL，16℃水浴12h，连接反应后形成携带短发夹结构VEGF的RNA干扰质粒，即pSUPER-shVEGF1和pSUPER-shVEGF2， 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 经感受态大肠杆菌DH5a克隆扩增，提取质粒备用。
　　1.2.3 JAR细胞的分组
　　组1：空白对照(未转染JAR细胞)组；组2：转染空pSUPER载体的细胞组；组3：转染含shVEGF1片段的pSUPER载体细胞组；组4：转染含shVEGF2片段的pSUPER载体细胞组。
　　1.2.4 阳离子脂质体法转染细胞
　　转染前24h将JAR细胞按2×105接种于6孔板中培养，待细胞生长至约80％融合度时弃培养基，用不含血清的RPMI－1640液洗涤细胞2次，在微量离心管中准备A1、A2、A3、B1、B2及B3液，A1、A2、A3液均为：250μL RPMI－1640液+5μLlipofectamineTM 2000；B1液：250μL RPMI－1640液+3μg空载体质粒；B2液：250μL RPMI-1640液+3μg shVEGF1载体质粒；B3液：250μL RP-MI－1640液+3μg shVEGF2载体质粒，将A1+B1，A2+B2，A3+B3液混合置室温下半小时后，分别加入0.8 mL RPMI－1640液，将A1+B1昆合液均匀滴加在组2细胞表面，A2+B2混合液均匀滴加在组3细胞表面，A3+B3混合液均匀滴加在组4细胞表面，组1细胞表面滴加RPMI-1640液，4组细胞37℃，5％CO2培养箱中培养6h，弃去转染液，换不含抗生素的完全培养液，培养36－48h．
　　1.2.6 嘌呤霉素筛选
　　转染48h后，用胰酶消化，传代培养，使细胞长至80％时，用0.8mg/L嘌呤霉素筛选，筛选10－14d，培养液中出现单克隆细胞株，挑单细胞株，继续嘌呤霉素扩大培养，每天应用倒置显微镜观察各组目的细胞的大小、形态、核浆比例及生长方式上的变化，并照相。
　　1.2.7 流式细胞仪检测细胞周期
　　收获2×106个细胞，PBS漂洗2次后，4℃70％乙醇固定30min，离心，弃乙醇，取500μLPBS液重悬细胞，加入RNaseA至终浓度100mg/L，37℃水浴30min，碘化丙啶(PI，20mg/L)染色30min，将组2，组3送流式细胞学检测，利用ModFit LT软件分析细胞周期．
　　1.2.8 RT-PCR检测各组JAR细胞中VEGF的基因表达
　　应用primer premier5.0软件设计VEGF及内参照β－actin引物，VEGF引物的扩增片段长度为534bp，内参照β－actin扩增产物片段长度为155bp，设计后交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，VEGF上游引物为5’－TcTrCAAGCCATCCTGTGTG-3′，下游引物为5’－ATCTGCATGGT－GATGTI"GGA-3′；看家基因β―actin的上游引物为：5′GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA3′，下游引物为：5′－AGAAAATCTGGCACCACACC3′。
　　因组1细胞在筛选中不能耐受嘌呤霉素而全部死亡，另取JAR细胞作为VEGF转染前对照，代替组1，取组1、组2、组3、组4细胞各3瓶，分别提取总RNA，RT-PCR检测各组细胞VEGF基因的表达，PCR反应条件为：95℃预变性1min 30s，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，然后再延伸5min，4℃终止反应．其间扩增5个周期时加看家基因β－actin引物．重复RT-PCR步骤3次，分别取RT-PCR产物1μL，2％琼脂糖凝胶电泳验证RT-PCR产物片段大小，EB染色，紫外凝胶摄像仪下观察照相，计算机扫描分析，以灰度为单位，VEGF/β－actin的灰度比作为每例标本VEGF的相对表达量。
　　1.2.9 数据分析
　　实验数据以±s表示，采用t检验进行统计学分析。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 转染后细胞的生长情况
　　嘌呤霉素筛选后1－4d，组2、组3、组4部分细胞开始变性坏死，但剩余细胞似失去接触抑制，表现为成堆生长，空白对照组细胞大部分死亡；筛选后11－12d，空白对照组细胞全部死亡，其余各组开始长出新的单克隆．经过近1月筛选后，除空白对照组外，均得到单克隆细胞株，说明转染成功，观察显示各组获得的单克隆细胞株仍平铺成片生长，可见大量分裂像，三组单克隆细胞生长情况相似。
　　
　　2.2 转染后JAR细胞株VEGF的基因表达
　　
　　RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图2，产物特异性好，可见VEGF和内参照β－actin扩增片段，未见其它扩增产物，与内参照相比，转染前JAR细胞及转染空pSUPER载体质粒组VEGF均呈强表达，转染shVEGF2组的VEGF表达条带明显较弱，shVEGF1组未见VEGF表达条带，转染空载体pSUPER载体质粒组VEGF平均相对表达量与空白对照组相比无明显差异，t=0.68，P=0.50>0.05：与转染空pSUPER载体质粒组相比，转染pSUPER-shVEGF1载体组及转染pSU-PER-shVEGF2载体组VEGF表达明显减少，t值分别为19.97、16.44，P值为0.00 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 shVEGF2的重组pSUPER质粒及携空pSUPER质粒的JAR细胞株，经过RT-PCR检测，稳定转染pSUPER-shVEGF1、pSUPER-shVEGF2的JAR细胞株VEGF基因表达受到了有效抑制，pSU-PER-shVEGF1组达到了VEGF基因沉默的效果，而未载有shVEGF的空pSUPER转染组的细胞仍显示VEGF条带，与未转染的细胞相似．提示本实验构建的质粒能稳定抑制VEGF mRNA表达，且成功建立了稳定转染VEGF质粒的JAR细胞株．其机制据Brummelkamp的研究，pSUPER载体系统不仅在RNA干扰中作为siRNA的载体，还可以在哺乳动物细胞内，以自身载有的siRNA为模板，复制产生新的特异性的siRNA的正义链与反义链的前体，并由于其配对特性，快速合成为siR-NA，发挥强而持久的RNA干扰作用。
　　
　　3.2 VEGF靶位点与RNA干扰效果
　　本实验在设计siRNA时，设计的序列为两组，shVEGF1序列的RNA干扰效果较好，而shVEGF2序列RNA干扰后，VEGF表达减少，但未被完全抑制，这可能和靶位置有关，这和Holen等的研究相似，Holent等发现在Hela细胞中，针对人凝血组织因子mRNA编码区设计的siRNA，其靶位点相互之间仅相差几个碱基(靶位点左右平移)，RNA干扰的抑制效应就表现出明显的差异，甚至效率相差超过50％，为避开位置效应的影响，在siRNA的设计时，要求尽量多选几个候选靶位点，来达到利用RNA干扰抑制目的基因表达的实验目的。
　　
　　3.3 VEGF在滋养细胞中的作用
　　VEGF是一种能产生多种效应的细胞因子，其生物学功能主要为促进血管的生成与增殖，促进内皮细胞的迁移，增加血管的通透性．VEGF除了在血管内皮细胞发挥作用外，在其他代谢旺盛的组织细胞中也有表达，如肾上腺皮质细胞、胚胎组织、垂体细胞及肿瘤细胞等，在病理条件下，特别是在恶性肿瘤细胞中，VEGF无论是在mR-NA水平还是在蛋白水平均有过量表达，
　　目前认为VEGF有促进滋养细胞增殖的作用，有研究显示，从妊娠开始，母体外周血血清中VEGF含量持续增高，7周时达到高峰，以后维持高水平，Chamock-Jones等在滋养细胞样绒毛膜癌细胞系(BeWo细胞)通过原位杂交方法检测到VEGF受体Flk-1和Flt-1 mRNA呈高强度表达，体外实验发现，用VEGF165处理的BeWo细胞有丝分裂原激活蛋白(MAP)激酶活化刺激细胞增殖作用与VEGF165呈剂量依赖关系．另采用滋养细胞株SGHPL-4体外侵入模型研究发现，与血管发生有关的细胞因子，尤其是血管内皮生长因子(VEGF)，可以增加滋养层细胞的运动性，可能参与滋养细胞的侵入，但也有研究显示，在培养的绒毛外滋养细胞株和BeWo绒癌细胞株中加入VEGF121可以促进滋养细胞增殖，此效应可以被VEGF抗体所阻断，加入VEGF165后无直接增殖活性，加入硫酸乙酞肝素糖蛋白(HSPGs)处理后的VEGF165方产生增殖效应，但VEGF的两种亚型VEGF165和VEGF121，对滋养层细胞的迁移和侵入均无作用，且滋养层细胞受VEGF增强的迁移力并不具有方向特异性，仅表现为杂乱无序的运动，并不利于其侵入，甚至对滋养层细胞的侵入具有抑制作用。
　　本研究观察RNA干扰VEGF基因表达前后细胞的生长情况显示，未转染质粒组，因不能耐受嘌呤霉素的压力而死亡，其他各组JAR细胞表面粗糙，表现为成堆生长，似失去接触抑制，是否与VEGF基因沉默后细胞间信号传递的改变有关尚需进一步探讨，不排除转染过程中阳性脂质体附着于细胞表面，致细胞表面电荷改变所致，因为各转染质粒组分别长出新的单克隆后，单克隆细胞仍呈平铺成片生长，流式细胞学检测转染pSU-PER-shVEGF1组与转染空载体组相比，细胞增殖无明显差异，这与Lala等报道的VEGF可促进绒毛外滋养细胞的增殖及Chamock-Jones所报告的VEGF促进滋养细胞样绒毛膜癌细胞系(BeWo细胞)的增殖不同，由此我们推断，血管内皮生长因子对于滋养细胞增殖作用的条件尚需进一步研究，VEGF对滋养细胞的增殖作用可能为间接作用，即通过对滋养细胞周围环境，如促进血管生成与新生作用，从而改善滋养细胞的营养而促进滋养细胞的发育与分化，此需要进一步的研究。
　　
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文