枯草芽孢杆菌产淀粉酶条件的优化 枯草芽孢杆菌怎么培养

　　摘要：以枯草芽孢杆菌为试验菌株，采用液态培养基发酵，探讨枯草芽孢杆菌产α－淀粉酶的最佳发酵条件，分别对碳源、氮源、发酵时间、接种量、培养基初始ｐＨ进行单因素试验，在此基础上对碳源浓度、氮源浓度、接种量、培养基初始ｐＨ这４个因素进行了Ｌ９（３４）正交优化试验。结果表明，葡萄糖优于其他碳源，尿素优于其他氮源，最佳培养时间为３０ ｈ；最佳发酵参数组合为ｐＨ ５．０，葡萄糖质量浓度０．２％，尿素质量浓度１．５％，接种量２．５％。
　　关键词：枯草芽孢杆菌；α－淀粉酶；最佳发酵条件；正交试验
　　中图分类号：Ｓ８１６．３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2315-03
　　
　　Ｏｐｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｍｙｌａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ sｕｂｔｉｌｉｓ
　　
　　ＺＨＡＯ Ｗａｎｇ－ｆｅｎｇ１，ＺＨＯＵ Ｊｉｎｇ２
　　（1. Department of Economics and Managment， Binzhou 256600，Shandong，China；
　　2. College of Life Science，Qufu Normal University，Qufu 273165，Shandong，China）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｉｎｇａｌ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ α－ａｍｙｌａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ． Ｆｉｖｅ ｆａｃｔｏｒｓ， ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ， ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ， ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐＨ， ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； and ｂａｓｅｄ ｏｎ these single factor tests， ｔｈｅ ｃａｒｂｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐＨ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎ Ｌ９（３４） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｗｅｒｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｃａｒｂａｍｉｄｅ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ３０ ｈ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｗａｓ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐＨ ｖａｌｕｅ， ５．０； ｃａｒｂｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ０．２％； ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， １．５％； ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ， ２．５％．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ； α－ａｍｙｌａｓｅ； ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ
　　
　　淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，广泛存在于动植物和微生物中。α－淀粉酶以内切方式水解淀粉底物的α－１，４糖苷键，水解产物为寡聚糖、麦芽糖和葡萄糖［１］，被广泛应用于酒精发酵、啤酒酿造、葡萄糖制造、糊精制造、糖浆制造、纺织品退浆、铜版纸加工、洗衣业、饲料加工及医药生产等领域［２］。用于工业生产α－淀粉酶的主要生物为芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）［３］，其中枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）广泛存在于土壤、水中，由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛应用［４］，本试验通过研究枯草芽孢杆菌产淀粉酶的影响因素，探讨最佳发酵条件，为α-淀粉酶在实际生产中的广泛应用提供依据。
　　１材料和方法
　　１．１试验材料
　　１．１．１菌种枯草芽孢杆菌分离自山东省曲阜市污水处理厂。
　　１．１．２培养基种子培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；发酵培养基用牛肉膏蛋白胨液体培养基。
　　１．１．３主要试剂和溶液的配制磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液（ｐＨ ６．０）：称取磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）４５．２３ ｇ、柠檬酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７・Ｈ２Ｏ）８．０７ ｇ，用蒸馏水溶解并定容至１ ０００ ｍＬ。配好后用ｐＨ计校正。质量浓度为２％的淀粉溶液：称取可溶性淀粉２．０ ｇ，用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入煮沸的水中，加热煮沸至透明，冷却后定容至０．１ Ｌ。
　　１．２试验方法
　　１．２．１粗酶液制备将枯草芽孢杆菌接种在种子培养基上，３７ ℃培养１２ ｈ，使其活化；将活化的枯草芽孢杆菌接种于发酵培养基中，３７ ℃恒温培养２４ ｈ后用漏斗过滤，取上清液，即为待测粗酶液。
　　１．２．２淀粉酶活力测定采用碘－淀粉法［５］测定酶活力：吸取２．０ ｍＬ质量浓度２％的淀粉溶液于试管中，加入磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液１．０ ｍＬ，摇匀，于４０ ℃恒温水浴保温５ ｍｉｎ。加入粗酶液１．０ ｍＬ，４０ ℃保温３０ ｍｉｎ后，加入０．５ ｍｏｌ／Ｌ乙酸溶液５．０ ｍＬ，混匀。吸取反应液１．０ ｍＬ，加稀碘液５．０ ｍＬ，混合均匀。以蒸馏水作为空白参比，于６６０ ｎｍ波长测定其吸光度（Ａ）。从标准曲线算出被酶消耗的淀粉量。酶活力以每毫克粗酶液在４０ ℃，ｐＨ ６．０条件下每小时所分解的淀粉质量来衡量。
　　１．２．３单因素试验在牛肉膏蛋白胨液体培养基基础上，分别改变培养基碳源、氮源、ｐＨ、接种量和培养时间，考察各因素对菌体产淀粉酶活力的影响。①改变培养基碳源为相同质量浓度的葡萄糖、蔗糖、牛肉膏或淀粉，接种量１．８８％，其他培养条件不变，测定各培养基产淀粉酶的差异。②以葡萄糖为碳源，改变培养基氮源为相同质量浓度的蛋白胨、尿素、硝酸铵或硫酸铵，接种量１．８８％，其他培养条件不变，测定各培养基产淀粉酶的差异。③以葡萄糖为碳源，尿素为氮源，接种量１．８８％，测定ｐＨ分别为５．０、６．０、７．０、８．０时各培养基产淀粉酶的差异。④以葡萄糖为碳源，尿素为氮源，调节各培养基初始ｐＨ为７．０，测定每４０ ｍＬ发酵培养基分别接种４００、６００、８００、１ ０００ μＬ种子培养基时产淀粉酶的差异。⑤以葡萄糖为碳源，尿素为氮源，调节培养基初始ｐＨ为７．０，接种量１．８８％，培养１２ ｈ后，每隔６ ｈ测１次酶活性，测定不同培养时间对菌体产淀粉酶的影响。单因素试验中每个处理均设置３个重复。
　　１．２．４正交试验在上述单因素试验基础上，对葡萄糖浓度、尿素浓度、初始pH和接种量４因素作了３水平的正交试验，各因素及水平见表１。
　　２试验结果
　　２．１碳源对菌体产淀粉酶的影响
　　测定不同碳源培养基产淀粉酶的活力，根据结果绘制图１。可以看出，４种碳源对酶活力影响不同，葡萄糖作为碳源时，淀粉酶活力最大，但是与牛肉膏作碳源时酶活力差异不显著，显著高于蔗糖和淀粉作为碳源的酶活力（Ｐ＜０．０５）。所以，葡萄糖和牛肉膏可以作为最佳碳源。
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　　测定不同氮源培养基产淀粉酶的活力，根据结果绘制图２。可以看出，氮源的不同对酶活力具有一定的影响，所产酶活力尿素＞蛋白胨＞硝酸铵＞硫酸铵，且尿素做氮源和其他３种氮源对酶活力的影响差异显著（Ｐ＜０．０５），硝酸铵与硫酸铵对酶活力的影响没有显著差异。
　　２．３初始ｐＨ对菌体产淀粉酶的影响
　　考察不同初始ｐＨ对菌体产淀粉酶的影响，根据结果绘制图３。由图３可以看出，不同初始ｐＨ条件下产生的酶活力有差异，初始ｐＨ为７．０时产生的淀粉酶活力最大，但是在Ｐ＝０．０５水平上，各处理组酶活力差异不显著，ｐＨ在５．０～７．０（中性偏酸）时，酶活相对较大。
　　２．４接种量对菌体产淀粉酶的影响
　　测定不同接种量条件下产生淀粉酶的活力，根据结果绘制图４。可以看出，接种量不同，酶活力不同，不同接种量所产生淀粉酶的活力大小顺序为：８００ μＬ、６００ μＬ、１ ０００ μＬ、４００ μＬ，其中８００ μＬ接种量产生的酶活力显著高于与其他３个接种量（Ｐ＜０．０５）。
　　２．５培养时间对菌体产淀粉酶的影响
　　考察不同培养时间所产淀粉酶的活力，根据结果绘制图５。可以看出，枯草芽孢杆菌产淀粉酶不同培养时间酶活力不同，３０ ｈ和３６ ｈ的酶活性在Ｐ＝０．０５水平上差异不显著，但是显著高于２４、１８、４２ ｈ的酶活力（Ｐ＜０．０５）。因此，最适培养时间是３０ ｈ，在３０ ｈ以内酶的活性随着时间的延长而升高，３０ ｈ后，所产酶的活性开始下降。
　　２．６正交试验
　　在单因素试验基础上，对葡萄糖浓度、尿素浓度、初始pH、接种量４因素作３水平的正交试验。由表２可以看出，对产酶活性影响最大的是培养基初始ｐＨ，其次是接种量和氮源浓度，葡萄糖浓度影响最小；最佳方案是ｐＨ ５．０，葡萄糖质量浓度０．２％，尿素质量浓度１．５％，接种量２．５％。
　　３讨论与结论
　　３．１淀粉酶活力测定时的注意事项
　　酶活力测定受多种因素影响［６］，测定过程中应注意以下几点：①取样前，要把水浴锅的水温调到需要的温度，保证各试管温度一致，避免因水温引起的误差；②取样时，速度要快、准确，避免样品损失带来的误差；③酶反应时，先往反应管中加底物溶液，后加酶提取液，而且一次不要做太多的样品，以避免加样先与后的时间差异对试验结果的影响；④加入乙酸，隔一段时间待乙酸完全终止反应后，再测吸光值；⑤测定吸光值时，先要检查比色杯是否有差异，避免因比色杯差异引起的误差；⑥用移液管量取液体时，应及时用蒸馏水冲洗，避免酶液间相互影响。
　　研究从碳源、氮源、培养基初始ｐＨ、接种量、培养时间５个单因素对枯草芽孢杆菌产α－淀粉酶的影响进行了探讨，得出枯草芽孢杆菌在葡萄糖作为碳源，尿素作为氮源，培养基初始ｐＨ在５～７，接种量为２．５％，培养时间为３０ ｈ时，产生的淀粉酶活力相对较高。经正交试验分析，采取培养基初始ｐＨ ５．０，葡萄糖质量浓度0.2％，尿素质量浓度１．５％，接种量２．５％这种方案时枯草芽孢杆菌产生的淀粉酶活力最高。
　　枯草芽孢杆菌生产的蛋白酶、淀粉酶是工业酶中应用最为广泛的酶，二者就占到了整个工业酶市场的５０％［７］。我国酶制剂工业近年来取得了长足的发展，但仍无法跟上世界同行业发展的步伐，科研乏力已成为制约中国酶工业发展的瓶颈因素。枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已被广泛应用于工业、农业、医药卫生、食品、畜牧业、水产等领域。随着经济的发展、科研水平的提高，枯草芽孢杆菌与人们日常生活的关系将更为密切，它也必将作为一种十分重要的工业微生物菌种越来越引起人们的关注和青睐。本试验通过研究枯草芽孢杆菌产淀粉酶的若干影响因素，进而确定其产酶的最佳条件，为α-淀粉酶在实际生产中的广泛应用提供依据。
　　参考文献：
　　［１］ 谷军．Α―淀粉酶的生产与应用［Ｊ］．生物技术，１９９４，４（３）：１－５．
　　［２］ 邱发福． 真菌 α―淀粉酶在面粉生产中的应用［Ｊ］． 粮油食品科技，１９９９，７（４）：２２－２３．
　　［３］ 杨慧，王振华，潘康成，等． 芽孢杆菌产淀粉酶活性的研究［Ｊ］． 现代农业科技，２００７（２）：９０－９３．
　　［４］ 马明，杜金华． 枯草芽孢杆菌酶在工业生产中的应用［Ｊ］． 山东科学，２００６，１９（３）：３５－３８．
　　［５］ 刘贺红，万金泉，马邕文，等． ＤＮＳ比色法测定污泥中淀粉酶活性的研究［Ｊ］． 安徽农业科学，２００８（３３）：１４３６９－１４３７１．
　　［６］ 王霞，黄卓烈． １，４－环氧六环对α－淀粉酶催化活性的影响［Ｊ］． 河北化工，２００８（１２）：４０－４１．
　　［７］ 仇丽． 枯草芽孢杆菌在养殖中的应用［Ｊ］． 渔业现代化，２００２（４）：１．
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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