三裂叶野葛【野葛叶蛋白质提取工艺研究】
摘要：以野葛叶为原料，采用水提醇沉法，通过单因素试验和正交试验，以凯氏定氮法测得野葛叶蛋白质含量和提取率，对提取温度、提取时间、溶液ｐＨ值、液料比４个因素进行优化研究，确定野葛叶蛋白质提取的最佳方法。结果表明，从野葛叶中提取蛋白质的最佳工艺条件为：提取温度９０ ℃，提取时间１２０ ｍｉｎ，提取溶液的ｐＨ值６，液料比１．４∶１（Ｖ／Ｗ，Ｌ∶ｋｇ）。
关键词：野葛叶；蛋白质；提取
中图分类号：Ｓ５６７．９；Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2298-03
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ｌｅａｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ（Ｗｉｌｌｄ．）Ｏｈｗｉ
ＨＥ Ｍｅｉ－ｊｕｎ１，ＬＩＡＯ Ｃｈａｏ－ｌｉｎ１，ＷＡＮＧ Ｈｕａ１，ＺＨＡＮＧ Ｙｕ１，ＭＵ Ｓｅｎ１，ＧＵＯ Ｈａｎ－ｊｉｕ１，ＨＥ Ｙｉｎ－ｓｈｅｎｇ１，
ＺＨＡＯ Ｒｅｎ－ｊｕｎ１，ＨＵＡＮＧ Ｄｏｎｇ－ｈａｉ２，ＬＩＡＯ Ｌｕ－ｊｉｎｇ１
（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈｅｒｂａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｅｎｓｈｉ ４４５０００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｅｎｓｈｉ ４４５０００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｅｔｈａｎｏｌ ｓｕｂｓｉｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ ｌｅａｖｅｓ． Ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐＨ， ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｌｅａｖｅｓof Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ９０ ℃； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， １２０ ｍｉｎ； ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐＨ， ６； ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ to ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ，
１．４∶１（Ｖ／Ｗ，Ｌ：ｋｇ）．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ（Ｗｉｌｌｄ．）Ｏｈｗｉ； ｐｒｏｔｅｉｎ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
野葛［Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ（Ｗｉｌｌｄ．）Ｏｈｗｉ］为豆科葛属植物，具有良好的药用价值及食用价值，被卫生部列为药食两用植物。野葛根富含淀粉及异黄酮类物质［１］，其中淀粉可食用性在我国及日本、韩国等周边国家均具有悠久的历史；异黄酮类物质具有降血压、降血脂、降血糖、扩张冠状动脉、防癌抗癌以及抗氧化等作用。目前，野葛的研究多集中在野葛根的药理药效和有效成分提取等方面［２－４］。而王淑惠等［５］对葛属植物叶的挥发性成分也进行了分析。目前对野葛叶蛋白质提取分离工艺尚未见报道。
因此，本研究主要是对野葛叶蛋白质提取工艺进行研究，旨在提高野葛的资源利用率，延伸野葛加工企业产业链。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１野葛叶试验用野葛叶均采自华中药用植物园。
１．１．２试剂氢氧化钠、盐酸、硫酸等均为分析纯。
１．１．３仪器旋转蒸发器，ＲＥ－５２，上海亚荣生化仪器厂；凯式定氮仪，ＫＤＹ－９８３０，北京华威兴业科技有限公司；恒温水浴锅，ＨＨ－Ｓ，上海索谱仪器有限公司；精密ｐＨ计，ＰＨＳ－２５Ｂ型，上海大普仪器有限公司；低速离心机，ＴＧ１６－ＷＳ，湘仪离心机仪器有限公司。
１．２方法
１．２．１单因素试验①以１ ｋｇ鲜野葛叶为原料，以１ ５００ ｍＬ水为提取液，提取时间为１００ ｍｉｎ，分别以５０、６０、７０、８０、９０、１００℃提取野葛叶蛋白质；②以１ｋｇ鲜野葛叶为原料，以１ ５００ ｍＬ水为提取液，７０℃为提取温度，分别提取野葛叶蛋白质６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０ ｍｉｎ；③以１ ｋｇ鲜野葛叶为原料，以
１ ５００ ｍＬ水为提取液，７０℃为提取温度，提取时间为１００ ｍｉｎ，分别以分析纯ＮａＯＨ、ＨＣｌ溶液调节提取液的ｐＨ值为４、５、６、７、８、９，提取野葛叶蛋白质；④以１ ｋｇ鲜野葛叶为原料，提取时间为１００ ｍｉｎ，取提取液的ｐＨ值为７，７０℃为提取温度，调节不同提取液的体积为１ ２００、１ ３００、１ ４００、１ ５００、１ ６００、１ ７００ ｍＬ，在不同液料比为１．２∶１、１．３∶１、１．４∶１、１．５∶１、１．６∶１、１．７∶１（Ｖ／Ｗ，Ｌ∶ｋｇ，下同）条件下提取蛋白质；⑤以１ ｋｇ鲜野葛叶为原料，以１ ５００ ｍＬ水为提取液，提取时间为１００ ｍｉｎ，７０℃条件下提取，在８０ ℃浓缩至１８０ ｍＬ，分别加入３６０ ｍＬ食用乙醇，使乙醇占总溶液体积分数为１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％，离心过滤得粗蛋白质。
１．２．２正交试验在单因素试验的基础上，确定提取温度、提取时间、提取液ｐＨ值、液料比４个因素，以蛋白质的提取率为评价指标，进行Ｌ９（３４）正交试验，因素与水平设计见表１。
１．２．３蛋白质含量的测定蛋白质含量测定采用微量凯式定氮法［６］。蛋白质的提取率为干燥后蛋白质含量除以野葛叶中的总蛋白质含量。
１．２．４验证试验按照正交试验中优选工艺进行验证试验，测定蛋白质的提取率。
２结果与分析
２．１单因素试验
２．１．１提取温度对蛋白质提取率的影响提取温度对野葛叶蛋白质提取率的影响见图１。由图１可知，随着提取温度的升高，野葛叶蛋白质的提取率升高，当温度达到８０ ℃时，野葛叶的提取率达到最高，但是随着提取温度的进一步的升高，蛋白质的提取率逐渐下降。因此，提取野葛叶蛋白质较优温度为８０℃。
２．１．２提取时间对蛋白质提取率的影响提取时间对野葛叶蛋白质提取率的影响见图２。从图２可知，提取时间在６０～１００ ｍｉｎ，野葛叶蛋白质的提取率随着提取时间的延长而增大；在１２０～１６０ ｍｉｎ，野葛叶蛋白质提取率趋于平稳，增幅不大。结合成本等因素综合考虑，较优提取时间为１２０ ｍｉｎ。
２．１．３ｐＨ值对蛋白质提取率的影响提取溶液的ｐＨ值对野葛叶蛋白质提取率的影响见图３。由图３可知，提取溶液的ｐＨ值为４~７时，野葛叶蛋白质的提取率的变化不大，随着ｐＨ值的升高，野葛叶蛋白质提取率逐渐减少，综合考虑设备及成本，较好的提取溶液ｐＨ值为６~７。
２．１．４液料比对蛋白质提取率的影响不同的液料比对野葛叶蛋白质提取率的影响见图４。从图４可知，液料比从１．２∶１至１．５∶１时，野葛叶蛋白质的提取率明显增大，而液料比从１．５∶１至１．７∶１时，野葛叶蛋白质提取率增幅不大，从而得出液料比为１．５∶１时，就能充分将野葛叶中的蛋白质提取出来，而较大的液料比增加了工艺生产中的浓缩时间，从而增加了工业成本，因此，较好的液料比为１．４∶１至１．５∶１。
２．１．５乙醇体积分数对蛋白质提取率的影响不同的乙醇体积分数对野葛叶蛋白质提取率的影响见图５。从图５可知，随着乙醇体积分数的增加，野葛叶蛋白质提取率逐渐增大，当乙醇体积分数达到８０％时，野葛叶蛋白质提取率趋于平稳。因此，８０％乙醇为提取野葛叶蛋白质的最佳沉降剂。
２．２正交试验结果分析
正交试验结果见表２，由表２极差分析可知各因素对蛋白质提取率的影响大小为Ａ＞Ｂ＞Ｄ＞Ｃ，从野葛叶中提取蛋白质的最佳工艺条件为Ａ２Ｂ２Ｃ１Ｄ１，即提取温度为９０℃，提取时间为１２０ ｍｉｎ，提取溶液的ｐＨ值为６，液料比为１．４∶１。
２．３验证试验
按最优工艺参数组合进行３次重复的验证试验，测得蛋白质的提取率为５９．７％，提取率较高，说明最佳工艺参数组合较优，对提取野葛叶中的蛋白质是可行的。
３结论
以水为溶剂，从野葛叶中提取蛋白质，得到影响蛋白质提取率的各个因素主次关系为：提取温度＞提取时间＞液料比＞提取液ｐＨ值；从野葛叶中提取蛋白质的最佳工艺条件为：提取温度９０℃，提取时间１２０ ｍｉｎ，提取溶液的ｐＨ值６，液料比１．４∶１。按该工艺参数组合提取野葛叶蛋白质，蛋白质的提取率可达５９．７％。工艺参数为综合加工野葛叶的阶段性研究结果，野葛叶中含有丰富的黄酮类化合物及纤维素，为提高原料的利用率，还有待进一步研究加工工艺。
参考文献：
［１］ 中华人民共和国药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［Z］．北京：化学工业出版社，２００５．
［２］ 张雁，张孝祺．葛根的营养保健功能及开发利用［Ｊ］．食品研究与开发，２０００（２）：３７－３９．
［３］ 钟耕，李天真．葛根淀粉颗粒性质的研究［Ｊ］．中国粮油学报，２００４，１９（５）：３３－３７．
［４］ 熊丽苹，黄立新，李彦萍．葛根淀粉理化性质的研究［Ｊ］．食品科技，２００４（５）：１０－１３．
［５］ 王淑惠，雷荣爱， 宋二颖， 等． 葛根地上部分挥发性成分的研究［Ｊ］. 中国药事，２００２，１６（２）：１０７－１０９．
［６］ 无锡轻工大学，天津轻工业学院．食品分析［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，２００５．２１６－２１９．
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