柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株成熟卵囊中葡萄糖含量的检测|柔嫩艾美耳球虫

　　摘要：建立了一种采用比色测定中性糖的硫酸－酚法测定柔嫩艾美耳球虫成熟卵囊中葡萄糖含量的方法，并对柔嫩艾美耳球虫（Ｅｉｍｅｒｉａ．ｔｅｎｅｌｌａ）的敏感株和各种耐药株共９个球虫株的成熟卵囊中葡萄糖含量进行了测定。结果表明，敏感株成熟卵囊中的葡萄糖含量较低，而耐药株成熟卵囊中葡萄糖含量则相对较高，二者比较呈现极显著相关性（Ｐ＜０．０１）。由此可见，柔嫩艾美耳球虫对抗球虫药物的敏感性可能与成熟卵囊中葡萄糖含量有关，通过对成熟卵囊中葡萄糖含量的测定可作为判别柔嫩艾美耳球虫是否耐药的指标之一。
　　关键词：柔嫩艾美耳球虫；敏感株；耐药株；葡萄糖含量
　　中图分类号：Ｓ８５２．７２＋３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）08－1647-03
　　
　　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｌｅｖｅｌ ｉｎ Ｍａｔｕｒｅ Ｏｏｃｙｓｔ of Ｄｒｕｇ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ or Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ Ｓｔｒａｉｎｓ
　　
　　ＭＡ Ｌｉ－ｎｏｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｚｈａｎｇ－ｌｉｕ２，ＹＵ Ｌｉａｎｇ－ｂｉｎ３
　　（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ５１８０５５，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ；
　　２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ；
　　３． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕａｎｇｇａｎｇ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ，Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｔｈｅ ｏｉｌ ｏｆ ｖｉｔｒｉｏｌ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｎｅｕｔｒａｌ ｓｕｇａｒｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｏｏｃｙｓｔ ｏｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｏｏｃｙｓｔ ｏｆ ９ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｉｎｓ ｉｎ Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ （ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｔａｉｎ ａｎｄ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｉｎｓ）ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， tｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｏｏｃｙｓｔ of sensitive strain ｗａｓ ｌｏｗ； ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｏｏｃｙｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｈｉｇｈ（Ｐ＜０．０１， ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）． Ｔｈｕｓ， ｔｈｅ ｓｔａｉｎｓ of Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ with ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ were ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｏｏｃｙｓｔ． Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｏｏｃｙｓｔ could ｂｅ ｕｓｅｄ as one of the indicators to ａｎｔｉｃｏｃｃｉｄｉａｌ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ of Ｅ. ｔｅｎｅｌｌａ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄs： Eｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ； tｈｅ ｄｒｕｇ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎ； tｈｅ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ； tｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ
　　
　　鸡球虫病是严重危害禽类生长发育，造成严重环境污染的一种疾病。集约化养鸡场是球虫病高发场所，目前防治鸡球虫病主要依赖于抗球虫药，但研究证实，鸡球虫几乎对所有使用过的抗球虫药都产生了耐药性。事实表明，任何一种抗球虫药在使用一定时间后，都会引起鸡球虫的耐药性，随着鸡球虫耐药性的产生，导致抗球虫药使用的年限缩短，防治失败或效果不佳，引起临床或亚临床球虫病，造成很大的经济损失。耐药性已成为鸡球虫病防治中最严重的问题之一［１］。寻找方便快捷检测鸡球虫耐药性的方法，有利于及时选用敏感药物，及时停用耐药性严重的药物，对减少鸡球虫病造成的损失具有现实意义［２］。为此，笔者一直在寻找方便快捷的检测鸡球虫耐药性的方法，曾对柔嫩艾美耳球虫敏感株和耐药株的子孢子膜脂流动性进行过比较检测，也对敏感株与抗药株的ＡＴＰ酶活性进行过比较检测［３，４］；本次试验发现柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株成熟卵囊中的葡萄糖含量存在显著差异，似乎也可以作为判别柔嫩艾美耳球虫是否对抗球虫药物产生耐药性的检测指标之一，且尚未见国内的相关报道，现将试验过程及结果报道如下。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　药物：地克珠利，０．２％饮水剂，华南农业大学实验兽药厂生产；百球清（甲基三嗪酮），２．５％饮水剂，德国拜耳公司（中国四川）生产；马杜霉素铵盐，９０．０％原粉，河南三宝（集团）中联发酵厂生产；盐霉素钠盐，１０％预混剂，广州朝阳兽药厂生产。以上药物用于抗药虫株的实验室诱导和野外分离株抗药性的检测。葡萄糖、甘露醇、硫酸等试剂均为分析纯。
　　虫株：以柔嫩艾美耳球虫作为研究对象，用受试抗球虫药，运用不同的方法分别对敏感株（表１中编号１）进行试验性诱导，最终形成表１中的２、３、６、９号诱导耐药性虫株，各抗药虫株的诱导方法将另文做详细报道。对野外采集分离得到的虫株进行上述４种抗球虫药物的耐药性检测，最终定出９株测试虫株，其中敏感株１株，诱导耐药株４株，野外耐药株４株，并将各虫株的编号、名称及其主要特征归纳于表１。
　　主要仪器：水浴振荡器，ＨＺＳ－Ｈ型，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；ＡＣＥ破碎乳化机（转速１８ ０００ｒｐｍ），ＡＭ－６型，日本精机制作所；超声波细胞破碎仪，５００ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司；岛津ＵＶ－５００１分光光度计，日本岛津株式会社；高速冷冻离心机，德国Ｈｅｔｔｉｃｈ公司。
　　
　　１．２测定样本的处理
　　１．２．１卵囊的繁殖与分离卵囊的繁殖采用１４日龄无球虫感染的粤黄鸡雏鸡进行，分次收集鸡盲肠中的卵囊进行分离纯化，获取纯净敏感株卵囊。具体胰蛋白酶消化法：将收集的盲肠及内容物尽量剪碎后，置于ＡＣＥ破碎乳化机的盛杯中， １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ匀浆５ ｍｉｎ，将盲肠组织充分打碎，倒入烧杯中，用１ ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液调节至ｐＨ值８．０，加入０．５％～１．０％胰蛋白酶，在３９℃水浴条件下消化２０ ｍｉｎ，使卵囊完全分散游离出来，然后依次用２００、３００、４００、５００目筛过滤，滤液以３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃上清，反复洗涤几次，充分洗去胰蛋白酶，向沉淀中加入适量的１．１ mol/L（比重为１．１２）蔗糖溶液，混匀，２ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，浮集于离心管上层的白色塞状物即为卵囊，用小铁丝网将卵囊捞于装有０．５ mol/L蔗糖溶液的离心管中，２ ５００ ｒ／ｍｉｎ，离心１０ ｍｉｎ，反复３～４次，除去比重较小的杂质，然后加入５％次氯酸钠溶液，４℃下作用１０ ｍｉｎ，用清水离心洗去次氯酸钠，最后将含有卵囊的清水以３ ０００ ｒ／ｍｉｎ，离心１０ ｍｉｎ，弃掉上清，沉淀即为纯净的未孢子化卵囊。将卵囊移入２．５％重铬酸钾液中，２８～３０℃下恒温通气培养２～３ ｄ，使卵囊孢子化，即为成熟卵囊。将孢子化成熟卵囊置于４℃冰箱保存备用。
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　　１．２．３葡萄糖的测定方法参照方福德等［５］对葡萄糖的测定方法，采用的比色测定中性糖的硫酸－酚法。此方法是最为普通而简单的中性糖检测方法，能检测５ μｇ／ｍＬ的葡萄糖含量。
　　１）葡萄糖标准曲线的测定。分别准确称取３份葡萄糖，配制成５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０ μｇ／ｍＬ ７个不同浓度梯度，分别经上述操作，用岛津ＵＶ－５００１分光光度计进行比色测定。将４９０ ｎｍ处测得的葡萄糖吸光值（x）与相应的葡萄糖浓度（）用直线回归，求得标准曲线方程和相关系数。见表２和图１。
　　２）样品中葡萄糖含量的测定。将各样品从－２０℃冰柜中取出，待其升至室温后，分别将每一虫株的孢子化卵囊匀浆上清液取０．５ ｍＬ于１．５ ｍＬ塑料离心管中，加入５００ ｍｇ／ｍＬ的三氯醋酸５０ μＬ沉淀蛋白质，再经１５ ０００ ｒ／ｍｉｎ高速离心１０ ｍｉｎ。吸取上清液０．３ ｍＬ于１０ ｍＬ玻璃离心管中，再分别加入０．５ ｍＬ ５％（W／V）酚的水溶液，在混旋器上充分混合后，直接向混合液的表面加入１．８ ｍＬ浓硫酸，立即在混旋器上，以较高转速剧烈振摇３０ ｓ。然后，室温放置３０ ｍｉｎ后，即可在岛津ＵＶ－５００１分光光度计上进行比色测定，记录每个样品在４９０ ｎｍ处的吸光值。将其代入直线回归方程中，求得不同虫株孢子化卵囊的葡萄糖含量，列入表３，并做统计分析，将结果进行分析比较。
　　２结果与分析
　　２．１葡萄糖标准曲线的测定结果
　　根据表２中的批次１的方程，将测得的对应浓度的葡萄糖吸光值绘制成标准曲线图。见图１。在葡萄糖比色测定中，其浓度在５～３２０ μｇ／ｍＬ范围内呈现良好的线性关系。有资料显示［６］，鸡球虫孢子化卵囊和子孢子中葡萄糖含量同样高（３００ μｍｏｌ／Ｌ），同时还存在较高浓度的甘露醇（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ，即
　　１０ ０００ μｍｏｌ／Ｌ）。为了弄清甘露醇是否会对葡萄糖的测定有影响，试验采用同样的方法对甘露醇进行了测定，结果证明甘露醇用此法呈现无变色反应。因此，用这一方法测定柔嫩艾美耳球虫不同虫株成熟卵囊中的葡萄糖含量时，可以排除甘露醇的干扰。
　　２．２敏感株与各种耐药株孢子化成熟卵囊中葡萄糖含量的比较
　　经过分别对９株参试虫株柔嫩艾美耳球虫敏感株和各种耐药株孢子化成熟卵囊中葡萄糖含量的测定，并经统计分析，结果见表３。从表３可见，敏感株孢子化成熟卵囊中的葡萄糖含量显著低于各种耐药株成熟卵囊中的葡萄糖含量，经统计分析，耐药株与敏感株差异极显著（Ｐ＜０．０１），因此，敏感株与耐药株成熟卵囊之间葡萄糖含量存在极显著的差异。而在各耐药株之间，无论是实验室诱导耐药株，还是野外耐药株，它们之间成熟卵囊中的葡萄糖含量无显著差异（Ｐ＞０．０５）。这一结果表明了柔嫩艾美耳球虫成熟卵囊中的葡萄糖含量增高与耐药性有着直接联系，同时也为解释敏感虫株总是比耐药虫株容易丧失活力提供了一个理论依据。
　　３小结与讨论
　　１）本文应用紫外可见分光光度计，以葡萄糖试剂为对照品测定了９株柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株成熟卵囊中的葡萄糖含量，方法简便，结果可靠。
　　２）各球虫耐药株成熟卵囊中的葡萄糖含量与敏感株相比显著增高，这可能与耐药虫株在对抗药物作用时需消耗大量能量有关，换言之，球虫敏感株的成熟卵囊中的葡萄糖含量较低，因而在对抗球虫药物作用时很容易被杀死。至于耐药株的成熟卵囊中葡萄糖含量升高的机理还有待进一步探索。
　　３）对于柔嫩艾美耳球虫卵囊中的葡萄糖含量有资料［６］显示为３００ μｍｏｌ／Ｌ，当将其与本文划为同一单位时，其含量仅只有０．３ μｍｏｌ／ｍＬ，但文献中并未说明测定的方法，而用本方法测定的柔嫩艾美耳球虫成熟卵囊中的葡萄糖含量远比资料中显示的要高，却能区分柔嫩艾美耳球虫敏感株和耐药株成熟卵囊之间葡萄糖含量的差异。
　　４）葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，属中性糖之一。葡萄糖在生物学领域具有重要地位，是所有动物生命活动中不可缺少的物质，是所有活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物。而对鸡球虫这类原生动物体内的葡萄糖代谢的机理还知之甚少。
　　参考文献：
　　［１］ 张会中，张润轮．鸡球虫的耐药性与应对措施［Ｊ］ ．养禽与禽病防治，２０１０（３）：２６－３１．
　　［２］ 吉尔格力，李伟奇，何南生． 鸡球虫抗药性的特点及其对策［Ｊ］．中国畜牧兽医，２００９，３６（７）：１９１－１９３．
　　［３］ 马立农，陈杖榴． 柔嫩艾美耳球虫敏感株和耐药株子孢子膜脂流动性的检测［Ｊ］． 西北农业学报，２０１０，１９（８）：１６－２１．
　　［４］ 马立农，陈杖榴． 对柔嫩艾美耳球虫敏感株与抗药株ＡＴＰ酶活性的检测［Ｊ］． 西北农业学报，２００６，１５（４）：８９－９２．
　　［５］ 方福德，杨焕明，张德昌，等．分子生物学前沿技术［Ｍ］． 北京：北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社，１９９８．
　　［６］ 索勋，李国清． 鸡球虫病学［Ｍ］．北京：中国农业大学出版社，１９９８．
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