[云南萝芙木中三种生物碱含量的HPLC法测定] 总生物碱含量测定方法

　　摘要：运用高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）测定云南萝芙木中育亨宾、阿吗碱、利血平３种生物碱的含量。采用岛津ＶＰ－ＯＤＳ Ｃ１８色谱柱（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ），流动相为甲醇－（０．００４ ｍｏｌ／Ｌ二乙胺）水系统，梯度洗脱，流速为１ ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长 ２７８ ｎｍ，柱温３０ ℃。结果表明，育亨宾在０．１４0～０．７00 μｇ（ｒ＝０．９９９ １）、阿吗碱在０．０９６～０．４８0 μｇ（ｒ＝０．９９８ 7）、利血平在０．１０４～０．５２０ μｇ（ｒ＝０．９９８ ８）范围内呈现良好的线性关系，平均加样回收率分别为９６．４％、９５．５％、９６．３％，变异系数分别为１．１５％、０．４８％、１．１４％。该方法可同时检测萝芙木根中育亨宾、阿吗碱、利血平3种生物碱，准确，快速，简便。
　　关键词：云南萝芙木；高效液相色谱；育亨宾；阿吗碱；利血平
　　中图分类号：Ｏ６５７．７＋２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2331-03
　　
　　 Determination of Yohimbine,Ajmalicine and Reserpine in Rauvolfia yunnanensis
　　Tsiang by HPLC
　　
　　ＤＥＮＧ Ｍｉｎｇ，ＣＡＯ Ｆｕ－ｘｉａｎｇ，ＬＯＮＧ Ｊｉａｎｇ－ｘｕｅ，ＤＯＮＧ Ｘｕ－ｊｉｅ，ＦＡＮ Ｈａｉ－ｙａｎ
　　（College of Life Science and Technology，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００４， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ（ＨＰＬＣ） ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｏｈｉｍｂｉｎｅ ，ａｊｍａｌｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ ｉｎ Ｒａｕｖｏｌｆｉａ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｔｓｉａｎｇ． Ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｏｎ ａ Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ２７８ｎｍ．Ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅｓ ｗｅｒｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．００４ｍｏｌ／Ｌ １，２－ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｆｏｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ａｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ３０℃．Ｔｈｅｙ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｆｏｒ ｙｏｈｉｍｂｉｎｅ， ａｊｍａｌｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅｓ ｏｆ ０．１４0～０．７00 μｇ（ｒ＝０，９９９ １）， ０．０９６～０．４８0 μｇ（ｒ＝０．９９８ ７）， ０．１０４～０．５２0 μｇ（ｒ＝０．９９８ ８） ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｗｅｒｅ ９６．４％， ９５．５％， ９６．３％ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ １．１５％，０．４８％，１．１４％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｏｈｉｍｂｉｎｅ， ａｊｍａｌｉｃｉｎｅ，ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ ｉｎ Ｒａｕｖｏｌｆｉａ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｔｓｉａｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ａｃｃｕｒａcy， speediness ａｎｄ conveniency．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｒａｕｖｏｌｆｉａ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｔｓｉａｎｇ； ＨＰＬＣ； ｙｏｈｉｍｂｉｎｅ； ａｊｍａｌｉｃｉｎｅ； ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ
　　
　　云南萝芙木（Ｒａｕｖｏｌｆｉａ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｔｓｉａｎｇ）为夹竹桃科萝芙木（Ｒａｕｖｏｌｆｉａ）属植物［１］。萝芙木中含有利血平（Ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ）、育亨宾（Ｙｏｈｉｍｂｉｎｅ）、阿吗碱（Ａｊｍａｌｉｃｉｎｅ）、利血胺、坎尼生等多种吲哚生物碱［２］。利血平具有降压、镇静和安定作用，是一种常用的降压药［３］。育亨宾用于治疗男性性功能障碍，同时还具有清风热、降肝火、消肿毒的功效［４］。阿吗碱有抗高血压、镇静、抗血管扩张和抗菌作用［５］。目前国内对萝芙木的研究主要集中在利血平和育亨宾的提取和检测上，检测方法主要为高效液相色谱法，但检测方法仅针对其中一种或两种生物碱，且同时检测育亨宾和利血平的时间近１ ｈ［６，７］。本文建立了以甲醇－水－二乙胺为流动相，运用梯度洗脱的高效液相色谱法同时测定萝芙木中育亨宾、利血平、阿吗碱3种生物碱，测定时间为４０ ｍｉｎ，有效缩短了分析时间，为进一步研究萝芙木的有效成分和质量控制提供依据。
　　１材料与方法
　　１．１仪器、试剂与材料
　　岛津ＬＣ２０１０ＡＨＴ高效液相色谱仪，岛津ＶＰ－ＯＤＳ Ｃ１８色谱柱（５ μｍ，４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ）。植物粉碎机、超声波清洗仪。
　　育亨宾标准品（ｓｉｇｍａ），利血平标准品（ｓｉｇｍａ），阿吗碱标准品（ｓｉｇｍａ），甲醇（色谱纯），二乙胺（色谱纯），其他试剂为分析纯。
　　干燥的云南萝芙木（产自云南省德宏州畹町地区），粉碎后过４０目筛，备用。
　　１．２方法
　　１．２．１育亨宾、阿吗碱和利血平对照品溶液的制备精密称取育亨宾标准品３．５ ｍｇ，阿吗碱标准品２．４ ｍｇ，利血平标准品２．６ ｍｇ，育亨宾和阿吗碱分别用甲醇溶解后定容到１０ ｍＬ，利血平用１ ｍＬ氯仿溶解后加甲醇定容到１０ ｍＬ。各取５ ｍL对照品溶液混合后定容到２５ ｍＬ，４ ℃避光保存，备用。
　　１．２．２云南萝芙木浸提液的制备准确称取云南萝芙木粉末（４０目）５．０ ｇ，加入甲醇超声３０ ｍｉｎ，超声３次，每次加入溶剂量为５０、３０、２０ ｍＬ。超声后抽滤，合并三次滤液定容到１００ ｍＬ，４ ℃避光保存，备用。
　　１．２．３色谱条件色谱柱：岛津ＶＰ－ＯＤＳ Ｃ１８（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ） 流动相：Ａ-甲醇；Ｂ-０．００４ ｍｏｌ／Ｌ二乙胺；梯度洗脱程序：０～２０ ｍｉｎ，６０％Ａ－４０％Ｂ；２０～４０ ｍｉｎ，Ａ：６０％→９５％，Ｂ：４０％→５％；流速：１ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长２７８ ｎｍ；柱温：３０ ℃。
　　２结果与分析
　　２．１色谱条件的优化
　　试验对比了等度洗脱和梯度洗脱条件，当流动相为甲醇６０％~４０％（０．００４ ｍｏｌ／Ｌ二乙胺）水时，育亨宾在１８ ｍｉｎ时出峰，分离度较好，但此条件下阿吗碱和利血平难以洗脱下来。因为利血平和阿吗碱的极性比育亨宾小，所以采用梯度洗脱，增大流动相中甲醇比例，在２０~４０ ｍｉｎ之间，线性改变流动相配比，将甲醇比例由６０％线性变为９５％，而（０．００４ ｍｏｌ／Ｌ二乙胺）水由４０％线性改变为５％。此时阿吗碱和利血平分别在３２ ｍｉｎ和３７．５ ｍｉｎ左右出峰，且与杂质峰分离效果好。最终确定流动相为０～２０ ｍｉｎ，６０％Ａ－４０％Ｂ；２０～４０ ｍｉｎ，Ａ：６０％→９５％，Ｂ：４０％→５％。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　２．２标准曲线线性方程的建立
　　取混合对照品按１．２．１项下色谱条件分别进样２、４、６、８、１０ μＬ，以峰面积为因变量，对照品含量为自变量进行线性回归，得回归方程见表１。图１为混合对照品和浸提液的色谱图。
　　２．３重现性和回收率试验
　　取混合对照品溶液重复进样５次，每次进样１０ μＬ，计算出育亨宾的变异系数为１．１５％，阿吗碱的变异系数为０．４８％，利血平的变异系数为１．１４％。
　　精确移取按１．２．２方法制备的提取液５ ｍＬ，分别加入准确质量的３种生物碱的标准品，经０．４５ μｍ微孔滤膜过滤，测得育亨宾的回收率为９６．４％，阿吗碱的回收率为９５．５％，利血平的回收率为９６．３％。
　　２．４样品测定
　　分别取云南萝芙木根、茎、叶按１．２．２方法制备样品溶液，经０．４５ μｍ微孔滤膜过滤，各进样１０ μＬ进行分析，计算出３种生物碱的含量，结果见表２。
　　３小结
　　该法以甲醇－水－二乙胺为流动相，运用梯度洗脱，共同检测了云南萝芙木中育亨宾、阿吗碱、利血平3种活性生物碱，测定时间约４０ ｍｉｎ，方法简便，分离效果好，准确可靠，可用于中药萝芙木的质量控制。
　　目前研究报道主要针对萝芙木中的利血平和育亨宾提取分离和检测，未见有关萝芙木中阿吗碱色谱检测方法的报道。试验结果表明，阿吗碱在萝芙木中含量较为丰富，可进一步研究从云南萝芙木中提取阿吗碱的工艺，提高对萝芙木的综合利用。
　　试验结果表明，3种生物碱在云南萝芙木根茎叶中均能检测到，只是各部位积累情况不同，有的含量很低。3种生物碱均在根部积累较多，在茎中含量也较为丰富，可考虑对萝芙木全株进行综合利用。在提取过程中应注意避光和控制操作温度，以免见光分解和高温损失。
　　参考文献：
　　［１］ 曹福祥，徐庆军，王承南，等．萝芙木属植物的物种和分布［Ｊ］．中南林业科技大学学报，２００７，27（６）：１５４－１５８．
　　［２］ 田学军，龙云惠，何英，等．绿春萝芙木资源薄层色谱鉴别［Ｊ］．红河学院学报，２００５，３（６）：２３－２４．
　　［３］ 张志信，张仕秀，宋关斌． Ｄ１５１大孔树脂－酸水法提取利血平的工艺研究［Ｊ］．药物生物技术，２００４，１１（３）：１５７．
　　［４］ 陈琴华，张卓，朱军，等． ＨＰＬＣ法测定育亨宾树皮中育亨宾的含量［Ｊ］．中国药房，２００７，１８（２８）：２２１３－２２１４．
　　［５］ 杨秀伟．生物碱［Ｍ］． 北京：化学工业出版社，２００５．
　　［６］ 龙云惠，田学军，黄兆龙．ＨＰＬＣ测定中药萝芙木中育亨宾的含量［Ｊ］．云南民族大学学报（自然科学版），２０１０，１９（２）：１３７－１３９．
　　［７］ 刘宇，孙蕾，冯雷，等． 高效液相色谱法测定萝芙木中育亨宾和利血平的含量［Ｊ］．中国生化药物杂志，２００８，２９（４）：１０７－１０９．
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