I基因 [玫瑰冠鸡ＩＧＦ－Ｉ基因多态性与体重及屠体性状关系的研究]

　　摘要采用PCR-RFLP技术，对100只玫瑰冠鸡的胰岛素样生长因子一I（IGF-I）基因的5′端调控区进行遗传多态性研究，该调控区的扩增产物经PstI酶切后出现 “-/-”“+/-”“+/+”3种基因型，其基因型频率分别是0.22、0.36和0.42。经x2检验，玫瑰冠鸡在IGF-I位点上处于哈代－温伯格平衡状态（P＞0.05）。分析基因型与12周龄体重和部分屠体性状时发现：玫瑰冠鸡在12周龄体重、半净膛重和胸肌重上都存在“-/-”＞“+/-”＞“+/+”的趋势，且在半净膛重和胸肌重上，“-/-”型和“+/-”个体显著高于“+/+”型个体（P＜0.05）；在12周龄体重上，“-/-”型显著高于“+/+”型个体（P＜0.05）。
　　关键词玫瑰冠鸡；胰岛素样生长因子-I；体重；屠体性状；PCR-RFLP
　　
　　巨型玫瑰冠鸡是我国古老的地方鸡种之一，其红色桑椹状的冠形恰似新疆天山上的雪莲，鲜艳夺目，并具有耐粗饲、抗寒耐暑以及抗病力强等优良生物学特性。现有的2 000多只玫瑰冠土鸡具有肉味鲜美、香气浓郁、细嫩可口等优良品质，这是我国乃至世界上宝贵的家禽种质资源和育种素材[1]。
　　在体重、屠体性状上，王金玉等[2]、Haberfeld等[3]、Lament等[4]用DNA指纹技术做过研究。颜炳学等[5]、欧阳建华等[6]分别对IGF-Ⅱ基因和IGF-I基因进行了多态性检测，表明基因与生长、屠体性状有关。孟和等[7]、赵建国等[8]和顾志良等[9] 分别对PPAR-a基因、解偶联蛋白基因和瘦蛋白受体（OBR）基因进行了单核苷酸多态性研究。
　　Baker等[10]、Siddiqui等[11]、Goddard等[12]、Scanes等[13]和Kang等[14]研究了IGF-I浓度和经济性状之间的关系。Nagaraja等对采食量、体重、产蛋量和蛋重与IGF-I多态性进行了研究，并指出了IGF-I基因型可用于选择[15]。但迄今，少有把IGF-I基因作为候选基因研究与屠体性状关系的报道。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1试验鸡选择和饲养
　　试验鸡选自石河子152团玫瑰冠鸡保种群，根据系谱从每家系随机选3～4只，共100只，单独组群，以扩大试验群的遗传基础，提高其代表性。试验鸡统一饲养于玫瑰冠鸡保种场，采用厚垫料饲养方式，免疫程序和饲养管理按一般管理方法进行，尽可能保证受试鸡的饲养管理条件相同。分0～3周、4～8周和8～12周三阶段饲养，所用颗粒料均购自天康饲料有限公司。
　　
　　1.2DNA多态性分析
　　1.2.1基因组DNA提取。翅静脉采血0.3mL放入1×STE 470μL、10%SDS 25μL，加入浓度为0.1mg/mL的Proteinase k 5.25μL，55℃水浴过夜，充分消化蛋白质和RNA；加入等体积的饱和酚（约550μL），轻摇10min，离心（12 000rmp）15 min，吸取含DNA的上清液；加入500μL苯酚、氯仿、异戊醇（25∶24∶1）混合液，轻摇10min，离心（12 000rmp）15min，吸取含DNA的上清液，用氯仿、异戊醇（24∶1）再抽提1次，加入1/10体积的NH4AC（约60μL），混匀，再加入2倍体积的预冷无水乙醇，轻轻混匀，可见絮状沉淀，4℃沉淀1h，离心（10 000rmp）10min后弃去上清液。将沉淀放置20～30min，使乙醇挥发干净，然后加入100μL TE于4℃冰箱保存备用。
　　1.2.2引物。所用引物参照Nagaraia等[15]提供的序列，序列如下：Forward 5′-GAC TAT ACAGAAAGAACCCAC-3"，Reverse 5′-TATCACTCAAGTGGCTCAAGT-3′。引物由上海生物工程有限公司合成。
　　1.2.3PCR扩增。采用25μL反应体系，10xBufer 2.5μL，MgCl2（25mmoL/L）1μL，dNTPs（2.5mmoL/L）1.5μL，前后引物（5pmoL/L）各1μL，DNATaq聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA 1μL，去离子水16.5μL。PCR反应循环参数为：94℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火120s，72℃延伸90s，共34个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色后检测扩增结果。
　　1.2.4酶切鉴定。取PCR产物12μL，PstI酶（10U/μL）1.5μL，10xBufer 1.5μL，加双蒸水至20μL，37℃酶切过夜，酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像分析系统拍照检测基因分型。
　　
　　1.3统计分析
　　所有数据均用SPSS11.0统计软件统计分析，基因型分布用x2检验。
　　
　　2结果
　　
　　2．1PCR及酶切结果
　　根据鸡IGF-I基因前导序列推算，目标扩增片段长度为621bp。本试验所扩增的片段长度经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测与之相符，且没有杂带，可以进一步作酶切鉴定（见图1）。
　　 酶切产物用2%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，所拍照片见图2。由图2可见，1个PstI酶切变异点，即1对等位基因，不能被酶切者标记为PstI“-”（621bp），能被酶切者标记为PstI“+”（364bp+257bp），有3种条带组合，即3种基因型（“+/+”“-/-”“+/-”）。这与S.C.Nagarala报道的结果一致。
　　
　　2.2基因频率和基因型频率
　　玫瑰冠鸡群IGF-I基因PstI酶切位点的基因频率和基因型频率见表1，统计分析发现基因频率和基因型频率在性别间分布差异不显著。两性中，“+”基因频率都大于“-”。无论公、母鸡还是整个试验群，基因频率分布均符合哈代－温伯格定律，P＞0.05。
　　
　　
　　2.3不同基因型生长的关系
　　根据最小二乘原理估出计线性模型中各因素、水平的效应值，用模型对原始数据进行校正，求得12周龄玫瑰冠鸡体重的最小二乘均数，并进行均数间的多重比较（见表2）。从表2可以看出：12周龄体重“-/-”型显著高于“+/+”（P＜0.05），且3种基因型间存在“-/-”＞“+/-”＞“+/+”的趋势，但“-/-”与“+/-”及“+/-”与“+/+”间差异不显著。
　　
　　3讨论
　　
　　本研究利用玫瑰冠鸡为研究对象，得到的IGF-I位点的基因型频率与Nagaraja等[15]和Seo等[17]分别利用白来航鸡和韩国本地鸡得到的结果稍有差异，这种差异可能存在于不同品种之间或者与鸡的不同经济类型有关。可能是由于对白来航鸡蛋产量进行长期的选择，使之IGF-I等位基因频率发生了偏离的缘故。但在不同的群体中等位基因“+”频率有较高的趋势。这能在一定程度上说明酶切位点的产生是点突变的结果。检验说明玫瑰冠鸡在该扩增位点上处于哈代－温格伯遗传平衡状态，这可能表明玫瑰冠鸡作为一种兼用的地方品种，在该位点上受到的选择影响较小或作为纯种得到了保护。
　　
　　
　　在本研究中12周龄体重和部分屠体形状表达的差异主要依赖于性别，而不是基因型，基因型仅在半净膛重和胸肌重上表现显著差异。这一点与闵令江等[16]、Seo等[17]的报道非常吻合，也表明IGF-I对生长和肌肉发育的影响是复杂的。在白来航鸡中IGF-I基因型除了与蛋及蛋壳重有关外，与体重、摄食和产蛋率等性状没有关系[15]，在韩国公鸡中“+/+”基因型比其他基因型表达更高的体重[17]。而在本研究中却发现不论性别，“-/-”＞“+/-”＞“+/+”，“-/-”基因型比“+/-”和“+/+”基因型总能表达更高的体重（12周龄）和部分屠体性状。这些不同可能反映了不同品种之间的不同遗传特性。对基因型与屠体性状的分析发现，“+/+”基因型同“+/-”和“-/-”型在半净膛重和胸肌重差异显著 （P＜0.05）。因此，根据这些结果可以初步认为，IGF-I基因可能是影响鸡的部分屠体性状的主基因或者与控制这些性状的主基因连锁，本研究成果可用于玫瑰冠鸡相关性状的标记辅助选择。
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　　4参考文献
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