多重PCR需要的引物_基于DPO引物的多重PCR在检测单增李斯特菌中的应用

　　摘要：根据单增李斯特菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）的ｈｌｙ、ｐｒｆＡ和ｉａｐ基因设计了３对常规引物和ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）引物，采用多重ＰＣＲ的方法，建立了单增李斯特菌的快速检测体系，并比较了常规引物和ＤＰＯ引物的优劣，结果表明ＤＰＯ引物的特异性强，能够快速准确地检测单增李斯特菌。
　　关键词：单增李斯特菌；ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）引物；多重ＰＣＲ
　　中图分类号：Ｒ３７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）15－3197-04
　　
　　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ DPO Primers
　　
　　ＬＩＵ Ｃｈｕｎ－ｚｈｅｎ１，ＷＡＮＧ Ｙｕｎ－ｌｏｎｇ２，ＪＩＮＧ Ｊｉａｎ－ｚｈｏｕ１
　　（１． Food and Bioengineering School Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２， Ｃｈｉｎａ；
　　２． Ｈｅｎａｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＤＰＯ） ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅs， ｈｌｙ， ｐｒｆＡ ａｎｄ ｉａｐ， ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）， ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ 3 pairs of ｒｅｇｕｌａｒ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＤＰＯ primers ｈａｄ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ primers， could detect L. monocytogenes accurately and quickly．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ； ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ） ｐｒｉｍｅｒｓ； ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ
　　单核细胞增生李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，简称单增李斯特菌）是危害公共卫生和食品行业的一种重要人畜共患病致病菌，使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成孕妇流产、死胎等疾病，病死率很高。它能够耐受低ｐＨ、高盐环境，并且能在较宽温度范围内生长［１］。近年来，很多的突发病例都与消费的食品被单增李斯特菌污染有关。因此，快速、准确地检测单增李斯特菌对于预防这些疾病的发生至关重要。目前，ＰＣＲ技术被广泛应用于单增李斯特菌的检测。多重ＰＣＲ是在常规ＰＣＲ基础上改进并发展起来的一种新型ＰＣＲ扩增技术，是在同一反应体系中加入多对引物同时扩增多条目的ＤＮＡ片段的方法［２］，采用这一技术可同时检测多种病原微生物。多重ＰＣＲ虽为一种特异灵敏、简便快速、高通量的检测技术，但如果实验条件控制不当，很容易导致扩增失败或非特异性产物［３］；引物的设计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏度和特异性。
　　近年来，一种新兴的ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）技术，既可保证扩增的特异性，又可大大提高扩增效率，为多重ＰＣＲ技术的应用提供了新的前景［４］。本研究采用ＤＰＯ技术，建立了多重ＰＣＲ检测体系，以达到快速准确检测单增李斯特菌的目的。
　　１材料与方法
　　１．１材料与仪器
　　菌种：单增李斯特菌（ＧＩＭ１．２２８）购于广东省微生物菌种保藏中心；试剂：１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶购于北京百泰克生物技术有限公司；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ购于宝生物工程有限公司；设备：梯度ＰＣＲ仪（美国ＡＢＩ公司），凝胶成像系统（美国ＵＬＴＲＡ． ＬＵＭ．Ｉｎｃ）。
　　１．２引物的设计与合成
　　根据单增李斯特菌的ｈｌｙ、ｐｒｆＡ、ｉａｐ基因的保守序列［５－７］分别设计３对常规引物以及相应的ＤＰＯ引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体如下（表１）。
　　１．３实验方法
　　１．３．１单增李斯特菌ＤＮＡ的提取Ｃｈｅｌｅｘ－１００法提取单增李斯特菌ＤＮＡ［８］。Ｃｈｅｌｅｘ－１００作为一种离子螯合剂，由苯乙烯和苯二乙烯组成。其悬液在碱性环境（ｐＨ １０～１１）和１００ ℃的条件下，可导致细胞膜的破裂和ＤＮＡ的变性并释放出来。①取适量细菌到１．５ ｍＬ离心管中，加入５００ μＬ纯水，剧烈振荡，室温下放置１５ ｍｉｎ。②１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３ ｍｉｎ，去上清，收集沉淀（必要时可用蒸馏水反复洗沉淀物，直至无色或色素很少）。③沉淀中加入２００ μＬ ５％ Ｃｈｅｌｅｘ－１００溶液（使用前充分振摇，使Ｃｈｅｌｅｘ－１００颗粒悬浮），在振荡器上反复振荡，５６ ℃保温３０ ｍｉｎ以上。④取出后振荡，１００ ℃保温８ ｍｉｎ，振荡后１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心３ ｍｉｎ，取上清液用于ＰＣＲ扩增，或放４ ℃保存备用。
　　１．３．２３重ＰＣＲ反应条件的优化以单增李斯特菌ＤＮＡ为模板，分别对常规引物和ＤＰＯ引物的３重ＰＣＲ的反应条件进行优化并比较。反应体系为２５ μＬ，包括１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋ ２．０ μＬ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２．０ μＬ，３对１０ μｍｏｌ／Ｌ引物各０．５ μＬ，３ Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶０．５ μＬ。对ＰＣＲ反应的退火温度、Ｍｇ２＋浓度、引物浓度等进行优化。
　　１．３．３ＤＰＯ引物与常规引物的特异性检测以金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌亚Ⅰ型、金黄色葡萄球菌亚Ⅱ型、沙门氏菌、乙型沙门氏菌、甲型沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、威尔氏李斯特菌、痢疾志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌（肉中提取、ＪＭ１０９、ＡＴＣＣ２５９２２、大肠杆菌Ｏ１５７）的ＤＮＡ为模板，分别用３个基因的常规和ＤＰＯ引物进行ＰＣＲ扩增，所得的ＰＣＲ产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
　　１．３．４ＤＰＯ引物多重ＰＣＲ的灵敏度检测将单增李斯特菌标准菌株培养至对数期，通过ＬＢ琼脂平板计数测菌落数。将菌样分别用超纯水进行倍比稀释，１２ ０００ ｒ/min离心２ ｍｉｎ，采用Ｃｈｅｌｅｘ－１００法抽提ＤＮＡ。ＰＣＲ反应程序为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，５８ ℃退火４０ ｓ，７２ ℃延伸５０ ｓ，３０个循环；７２ ℃延伸７ ｍｉｎ。取ＰＣＲ产物７ μＬ进行琼脂糖凝胶电泳（６０ Ｖ １ ｈ），照相观察和分析。
　　２结果与分析
　　２．１３重ＰＣＲ反应条件
　　２．１．１退火温度对常规引物和ＤＰＯ引物的３重ＰＣＲ的退火温度进行优化，电泳结果见图１、图２，两种引物在５５～５９ ℃之间都能扩增出目的条带，但ＤＰＯ引物扩增出的条带亮度更好。
　　２．１．２Ｍｇ２＋ 浓度对常规引物和ＤＰＯ引物的３重ＰＣＲ的Ｍｇ２＋浓度进行优化，电泳结果见图３、图４。Ｍｇ２＋浓度较低时，两种引物都仅能扩增出２条目的条带；Ｍｇ２＋浓度大于２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，ＤＰＯ引物扩增出３条目的条带，而常规引物扩增出非特异性条带。由此可见Ｍｇ２＋对ＤＰＯ引物的影响较小，用ＤＰＯ引物扩增时，在较高Ｍｇ２＋浓度条件下也能保证扩增的特异性。此后的反应中，在２５ μＬ ３重ＰＣＲ反应体系中添加Ｍｇ２＋浓度为１．８ ｍｍｏｌ／Ｌ。
　　２．１．３引物浓度由图5和图6可知，不同浓度的常规引物和ＤＰＯ引物都能扩增出３条目的条带，都有很强的特异性。此后的反应中，在２５ μＬ ３重ＰＣＲ扩增体系中添加３种引物的上下游引物浓度都为２００ ｎｍｏｌ／Ｌ。
　　２．２ＤＰＯ引物与常规引物特异性比较
　　对常规引物和ＤＰＯ引物的特异性检测结果见图7和图8。ＤＰＯ引物仅在单增李斯特菌扩增出目的条带，而常规引物在大肠杆菌（肉中提取）、威尔氏李斯特菌和宋氏志贺氏菌中均有非特异性条带出现。因此，ＤＰＯ引物的特异性要强于常规引物。
　　２．３ＤＰＯ引物与常规引物灵敏度的比较
　　ＬＢ琼脂平板计数法测得单增李斯特菌的菌体浓度约为１０８ CFU／ｍＬ。将菌液稀释，分别用常规和ＤＰＯ引物进行３重ＰＣＲ扩增。从图9、图10可以看出常规和ＤＰＯ引物扩增单增李斯特菌的检测灵敏度都为１０７ CFU／ｍＬ，没有太大差别。ＤＰＯ多重PCR体系中菌体稀释到１００倍以后就没有条带出现，并没有表现出优势，这可能与ＤＰＯ引物的结构有关，需要进一步研究。
　　３结论
　　ＤＰＯ引物具有特殊的结构，引物自身以及引物之间很少形成二级结构，试验过程中不需要对引物进行筛选，从而可以简化操作步骤［９］。ＤＰＯ引物特异性强，与模板发生错配的几率很小，一旦有３个以上碱基错配，就不会成功扩增［１０］。本研究中ＤＰＯ引物与常规引物相比，在退火温度上没有表现出很大的优越性，但对Ｍｇ２＋浓度不敏感，在高Ｍｇ２＋浓度下还能保证扩增特异性。
　　本研究建立的ＤＰＯ多重ＰＣＲ方法可在较短时间内准确地完成对单增李斯特菌的检测。其与常规引物的对比表明ＤＰＯ引物具有很强的特异性，ＤＰＯ引物的应用可以解决限制多重ＰＣＲ发展的非特异性问题，具有较强的应用价值。
　　参考文献：
　　［１］ 徐伟，李素芳，刘军． ＰＣＲ技术检测单核细胞增生李斯特氏菌研究进展［Ｊ］． 生物技术通报，２００８（１）：９５－９９.
　　［２］ 宋岱松．多重ＰＣＲ技术在食品安全检测中的应用［Ｊ］． 山东畜牧兽医，２００９，３０（５）：５７－５８．
　　［３］ 韦兵， 刘永松，赵明． 食源性致病菌快速检测方法研究进展［Ｊ］． 河北农业科学，２００８，１２（２）：３－５．
　　［４］ ＣＨＵＮ Ｊ Ｙ，ＫＩＭ Ｋ Ｊ，ＨＷＡＮＧ Ｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ ｇｅｎｅ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，３５（６）：ｅ４０．
　　［５］ 陈伟，杨迎伍，邓伟，等． ３种致病菌多重ＰＣＲ检测体系的建立及应用［Ｊ］． 食品与发酵工业，２００８，３４（９）：１３２－１３６．
　　［６］ 徐伟，刘军，李素芳． 单增李斯特菌与志贺氏菌多重ＰＣＲ检测技术的建立［Ｊ］． 中国食品学报，２００９，９（１）：２０１－２０６．
　　［７］ 李盛丰，赵娇，钟名华，等．单增李斯特菌不同ＰＣＲ快速检测方法比较［Ｊ］，中国公共卫生，２００８，２４（８）：１０２１－１０２３．
　　［８］ 景建洲，赵培培，王博飞． 利用Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ检测食源性致病志贺氏菌［Ｊ］. 食品科技，２０１０，３５（１）：２９３－２９６．
　　［９］ ＫＩＭ Ｊ Ｋ，ＬＥＥ Ｈ Ｊ，ＬＥＥ Ｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｍｕｔａｎｔｓ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｄｕａｌ－ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，１４９（１）：７６－８４．
　　［１０］ 刘梅，黄新，马占鸿，等． 应用ＤＰＯ引物检测马铃薯病毒的多重ＲＴ－ＰＣＲ技术研究［Ｊ］． 植物病理学报，２００９，３９（４）：４３１－４４４．