一株产甘草酸内生真菌的分离及代谢产物分析 复方甘草酸苷片价钱

　　摘要：采用组织块法从采自内蒙古鄂尔多斯市的甘草根部分离纯化内生真菌，经液体发酵培养，抽提发酵粗产物，以甘草酸为标准品采用LC-MS法和ＨＰＬＣ法对这些真菌的代谢产物进行筛选，获得１株产甘草酸的内生菌，通过形态学研究初步确定该菌株为镰孢霉属。
　　关键词：甘草；内生菌；甘草酸
　　中图分类号：Ｑ９４９．３２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2841-03
　　
　　Isolation of an Glycyrrhizic Acid-producing Andophytic Fungus from Licorice and Analysis of Metabolites
　　
　　ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｘｉａ，ＬＩ Ｙａ－ｌｉ
　　（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ， Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂａｏｔｏｕ ０１４０１０， Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ ａｃｉｄ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ endophytic fungi ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ the rats of ｌｉｃｏｒｉｃｅ in Erdos city of ｔｈｅ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ by tissue culture method．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ． Ｔｈｅ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｗａｓ extract and ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ａｎｄ ＬＣ－ＭＳ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ ａｃｉｄ ｓｔａｎｄａｒｄ． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ Ｂ１２ that was found as the glycyrrhizic acid-producing andophytic fungus ｗａｓ ｇｒｏｕｐｅｄ ｉｎｔｏ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｉｔｓ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｉｃｏｒｉｃｅ； endophytic fungi； ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ ａｃｉｄ
　　
　　内生真菌（Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ）是指生活在健康植物组织内部，但不引起植物病害的真菌。不仅能够参与植物次生代谢产物的合成和转化，还能独立产生丰富的次生代谢产物，是天然产物的重要来源和具有高度开发价值的新型生物资源。自从１９９３年Ｓｔｉｅｒｌｅ等［1］首次报道了从太平洋紫杉树中分离出一种产紫杉醇的内生真菌以来，许多研究者在多种植物中分离到了能产生与宿主相同或相似生理活性代谢产物的内生菌。迄今为止，已从夹竹桃科、小檗科、杜仲科、禾本科、红豆杉科等多年生药用植物内生真菌中分离到多种活性物质［２］。甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｉｎｆｌａｔａ Ｂａｔ．）为豆科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）多年生草本植物，以干燥的根及根状茎入药。主要有效成分甘草酸（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ ａｃｉｄ）为五环三萜皂甙化合物，不仅具有增甜、增香和增加风味的作用，而且还具有抗炎、抗变态反应、抗病毒包括抗肝炎病毒、抗艾滋病（ＡＩＤＳ）病毒和抗单纯疱疹病毒等作用，被广泛应用于食品和药品等领域。由于甘草酸结构复杂，无法人工合成，甘草酸的获得只能从甘草根中提取，而野生甘草资源已近枯竭，人工种植周期过长、组织培养技术目前实现甘草酸的工业化生产还比较困难，因此筛选和利用内生菌来生产甘草酸有可能是一种全新的选择［３］。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１甘草样品在内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗梁外甘草标准化示范区采集甘草完整植株，随机选取根部装入灭菌纸袋内编号备用。
　　１．１．２培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）：马铃薯２００．０ ｇ，葡萄糖２０.0 ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，琼脂１５．０～２０．０ ｇ，加水定容到
　　１ ０００ ｍＬ，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ，去琼脂为液体培养基。查氏培养基：ＮａＮＯ３ ２．００ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．００ ｇ，ＫＣｌ ０．５０ ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５０ ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，蔗糖３０．００ ｇ， 琼脂１５．０～２０．０ ｇ，加水定容至１ ０００ ｍＬ，１×１０５ Ｐａ灭菌３０ ｍｉｎ。
　　１．１．３主要试剂和仪器甘草酸标准品购自阿拉丁试剂（中国）有限公司，纯度＞９９．０％（ＨＰＬＣ）；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯，均购自国药集团上海化学试剂厂。高速冷冻离心机ＴＧＬ－１６Ｇ（上海安亭科学仪器厂），低速台式离心机ＴＤＬ－５Ａ（上海安亭科学仪器厂），Ａｇｉｌｅｎｔ－１１００高效液相色谱仪（美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司）。
　　１．２方法
　　１．２．１甘草样品预处理用无菌水洗净甘草的根表面，无菌刀剥去外皮，取内皮和韧皮部，同时剪成０．５ ｃｍ×０．５ ｃｍ的小块，用７５％乙醇浸泡５～１０ ｍｉｎ表面消毒，然后用无菌水冲洗５ｍｉｎ去除表面消毒剂，再用０．５２５％ ＮａＯＣｌ浸泡７ ｍｉｎ，无菌水冲洗５次，无菌滤纸吸干水分［４］。
　　１．２．２内生真菌的分离和纯化经过预处理的材料接种于ＰＤＡ固体培养基上，２５ ℃培养，待菌落长出后，挑取不同形态菌丝，接种于新鲜ＰＤＡ培养基上，培养３～５ ｄ后，再挑取菌丝分离单个菌落，如此反复纯化多次，得到纯化菌株［５］。
　　１．２．３内生真菌形态观察将纯化培养物接种到查氏培养基上，２８ °Ｃ下倒置培养，待刚长出菌丝时，将无菌的盖玻片斜插入平板内（插片法），继续培养至菌丝爬满盖玻片，将玻片取出，在显微镜下观察其特征。根据形态学特征，包括菌落的生长速度、菌丝体以及孢子的特征、分泌色素等，参照丝状真菌的分类鉴定方法将上述真菌菌株鉴定到适当的属［５］。
　　１．２．４内生菌发酵培养将分离纯化的菌株接入２５０ ｍＬ三角瓶中（含ＰＤＡ液体培养基５０ ｍＬ），２５ ℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ发酵培养７ ｄ。
　　１．２．５发酵产物的提取发酵结束后真空抽滤，分别收集滤液和菌丝体。滤液用等体积的二氯甲烷萃取３次，合并上层有机相；菌丝体冻融后充分研磨，加入３０ ｍＬ乙酸乙酯，超声萃取１５ ｍｉｎ，有机相与前述有机相合并，于旋转蒸发仪上３５℃去除有机溶剂，得到的萃取物溶于１ ｍＬ甲醇中，供检测用［６］。
　　１．２．６ＨＰＬＣ检测色谱条件：色谱柱为Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８；流动相为甲醇－０．２ ｍｏｌ／Ｌ 醋酸铵溶液－冰醋酸（６７∶３３∶１）；流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长为２５１ｎｍ；柱温为３０ ℃；进样量为１０ μＬ。
　　精密称取甘草酸标准品２ ｍｇ，甲醇定容至１０ ｍＬ，得母液浓度为０．２ ｍｇ／ｍＬ，将母液依次稀释成浓度梯度为０．１０、０．０８、０．０４、０．０２和０．０１ ｍｇ／ｍＬ，取１０ μＬ进样（ｎ＝５），得回归方程为＝５．０６１ ４ｘ－４５．６７８ ０，ｒ２＝０．９９８ ５。建立标准曲线，将标准品和样品分别进行ＨＰＬＣ分析［７－９］。
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　　２结果与分析
　　２．１菌种分离
　　从甘草根部共获得了３６株单一的丝状真菌。其主要分离部位为韧皮部，因植物材料表面严格消毒并整个过程在超净工作台中进行无菌操作，故上述纯化菌株均可确认为是甘草的内生真菌。
　　２．２ＨＰＬＣ检测结果
　　ＨＰＬＣ分析结果（图１）表明，标准甘草酸的保留时间为５．１８５ ｍｉｎ，而与之相似的是菌株Ｂ１２发酵纯化产物的保留时间为５．２０7 ｍｉｎ。由此可以初步判断菌株Ｂ１２发酵纯化产物与标准甘草酸峰为同一物质。
　　２．３ＬＣ－ＭＳ分析
　　在液质联用分析中，甘草酸标准品产生一个ｍ／ｚ为８２１．５的离子峰和一个ｍ／ｚ为８４３．５的离子峰（图２），菌株Ｂ１２发酵纯化产物也产生一个ｍ／ｚ为８２１．５的离子峰和一个ｍ／ｚ为８４３．５的离子峰。结果表明，甘草酸标准品和发酵纯化产物的LC-MS图谱基本一致，其中８２１．５和８４３．５处的两离子峰是甘草酸分子的［Ｍ-Ｈ］-和［Ｍ－Ｈ＋Ｎａ］-，因而可以说明菌株Ｂ１２发酵纯化产物中含有甘草酸。
　　２．４甘草酸的含量测定结果
　　精密称取甘草酸标准品１ ｍｇ，甲醇定容至１０ ｍＬ，得母液浓度为０．１ ｍｇ／ｍＬ，取配置好的甘草酸标准品溶液以无水甲醇稀释，分别配制成１０、５０、１００、２００、１ ０００ μｇ／ｍＬ的标准品溶液，摇匀，得系列浓度对照品标准溶液。分别精取上述对照品溶液各１０ μL在设定好的色谱条件下在高效液相色谱下进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，相应的浓度为横坐标，得标准曲线方程为＝５．０６１ ４ｘ－４５．６７８ ０，ｒ２＝０．９９８ ５，将样品进样所得峰面积代入方程得甘草酸产量为３４６．１ μｇ／Ｌ。
　　２．５内生真菌形态特征及分类
　　从已分离纯化的菌株中获得４株可以产甘草酸的内生真菌，其中编号为Ｂ１２的菌株在查氏培养基上生长较快，２８ °Ｃ培养７ ｄ，初期为短绒状菌丝，逐渐向培养皿四周生长，后期菌落中央颜色变深，深色部分为分生孢子团，白色部分即分生孢子团边缘围绕的无色菌丝（图３）。菌丝呈棉絮状至绒毛状，最初白色，后期逐渐变灰黑，培养基反面暗色；菌丝有隔、分枝、透明，直径１．５～３．５ μｍ。根据该菌株的形态学特征，查阅相关文献与镰孢霉属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）的分类特征基本一致，菌株Ｂ１２暂定为镰孢霉属。
　　３小结与讨论
　　在长期的共生环境中，内生真菌和宿主植物相互作用，建立了平衡关系，在植物体内形成相对稳定的真菌菌群，为此很可能获得了相关基因的直接传递，能产生与宿主相同的成分。药用植物中的内生真菌具有丰富的多样性，可以产生与宿主相同的在医药、农业、工业等行业有重要应用价值的活性物质。利用内生真菌发酵实现生物活性物质的工业化生产，可以提高产量、降低产品成本，满足人们日益增长的需求；同时有利于珍稀、濒危药用植物资源的保护，减少野生药用植物多样性的破坏。
　　研究从内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗采得的甘草中分离得到一株产甘草酸内生真菌，经过形态学特征研究分析，初步鉴定该菌株为镰孢霉属。通过ＨＰＬＣ、ＬＣ－ＭＳ分别对菌株Ｂ１２发酵产物进行分析检测，确定其产甘草酸，产量为３４６．１ μｇ／Ｌ，和已报道的甘草酸生产真菌相比，该菌株产量较高。目前已报道的内生真菌的发酵产量均比较低，通过分离筛选高产量的菌株，优化发酵条件，对菌株进行诱变育种等方式有望提高产量。该菌株在ＰＤＡ液体培养基中生长较快、产率稳定，有利于通过驯化、诱变育种及优化发酵条件来提高甘草酸的含量，以达到工业化生产的要求。
　　
　　参考文献：
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