【盐胁迫对小麦幼苗POD活性和同工酶的影响】小麦幼苗过氧化物酶同工酶

　　摘要：研究了０．４ ｍｏｌ／Ｌ氯化钠（ＮａＣｌ）处理后４个河南广泛种植的小麦品种幼苗根和叶中过氧化物酶（ＰＯＤ）活性及其同工酶酶谱的变化情况。结果表明，４个小麦品种在盐胁迫处理后，根和叶中的ＰＯＤ活性均有不同程度的增强，且无论是对照还是盐胁迫处理，根中的ＰＯＤ活性都要高于其叶中的ＰＯＤ活性。ＰＯＤ同工酶酶谱在不同小麦品种间的不同组织中存在差异性，根中的ＰＯＤ同工酶酶带总体染色比叶中深；经盐胁迫处理后，根和叶中的酶带颜色均有不同程度的加深。
　　关键词：盐胁迫；小麦；ＰＯＤ活性；同工酶
　　中图分类号：Ｓ５１２．１．０１；Ｑ９４５．７８；Ｑ５５４＋．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1759-03
　　
　　Effect of Salt Stress on Peroxidase and Isoenzyme in Wheat Seedlings
　　
　　ＳＯＮＧ Ｙａｎｇ，ＰＥＩ Ｄｏｎｇ－ｌｉ
　　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｇｑｉｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｑｉｕ ４７６０００，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＯＤ） ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ ｚｙｍｏｇｒａｍ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＯＤ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｗｈｅａｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ was studied． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｚｙｍｏｇｒａｍ ｏｆ ＰＯＤ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｗｈｅａｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ． Ｔｈｅ ｚｙｍｏｇｒａｍ ｓｈｏｗｅｄ ｄｅｅｐｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ． Ａｆｔｅｒ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ， ｓｏｍｅ ｚｙｍｏｇｒａｍ ｂａｎｄｓ ｂｅｃａｍｅ deeper ｂｏｔｈ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ，indicating that sａｌｔ－ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｕｌｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ＰＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ． Ｍｏｒｅｏｖｅｒ， ＰＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ， both ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ and ｔｈｅ ｓａｌｔ－ｓｔｒｅｓｓ ｇｒｏｕｐ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ；ｗｈｅａｔ；ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ； iｓｏｅｎｚｙｍｅ
　　同工酶（Ｉｓｏｚｙｍｅ，Ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ）广义是指生物体内催化相同反应而分子结构及理化性质不同的酶，几乎存在于所有生物体中［１］。同工酶作为一类蛋白质，广泛存在于生物的同一种属，同一个体的不同组织，同一组织或同一细胞中。同工酶具有多态性，同一种内的不同种个体，甚至同一个体的不同部位、不同发育时期，其同工酶都有差异［２］。同工酶技术是生物化学和分子生物学不断发展的产物，在遗传育种、生理学、病理学、系统分类学等学科都有广泛的应用［３］。
　　过氧化物酶（ＰＯＤ）及其同工酶作为植物细胞内重要的组成成分，其主要功能为：参与活性氧代谢过程；参与木质素和木栓质的合成；参与生长素的降解；参与许多物质如谷胱甘肽、草酰乙酸、氢醌、酪氨酸、阿魏酸等酚类化合物的氧化；参与环境胁迫［４］。ＰＯＤ活性的高低可以反映植物生长发育及内在代谢情况，同时也是植物抗性好坏的标志之一［５］。
　　近年来，盐胁迫环境下植物基因表达的研究日益受到重视［６］。盐胁迫是一种常见的逆境胁迫，土壤盐渍化是世界粮食生产的大害，是限制农作物生产和产量的重要因素之一。全世界大约有占全部土地面积２５％的土壤盐渍化，次生盐渍化土壤面积也在不断扩大［７，８］。近些年发现，抗盐性的决定因素普遍存在于各种植物中，植物对盐胁迫的反应是一个复杂的生理过程［９］。高盐胁迫加剧植物体活性基团的产生，过量的活性物质会诱发膜脂质过氧化，造成植物体氧化性损伤，破坏膜结构，并使线粒体破损，液泡增大［１０］。
　　豫东平原作为河南省重要的农产区，盐胁迫在当地分布较为普遍，对当地的小麦生产有着重要的影响［１１］。本试验以河南省广泛种植的４个小麦品种为材料，研究在０．４ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ胁迫处理下［１２］，各小麦品种在胁迫前后ＰＯＤ活性及同工酶酶谱的变化情况，旨在探究其变化规律，以期为筛选出具有较强抗盐性的小麦品种提供生化依据，为小麦抗盐基因的筛选与克隆提供参考。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　选用河南省广泛种植的具有代表性的４个小麦品种，分别是新麦１８、烟辐１８８、周麦１８、濮麦９号。
　　１．２方法
　　１．２．１材料的处理在４个小麦品种中各选取５０粒成熟饱满的种子，用１ g/L的氯化汞（ＨｇＣｌ２）溶液消毒处理１０ ｍｉｎ，流水冲洗１０ ｍｉｎ，２５ ℃催芽２４ ｈ后，将萌发一致的种子播种于装有石英砂的花盆中，置于温室中培养，昼温（２８±２）℃，夜温（２０±２）℃，相对湿度８０％。每天浇灌１／２ Ｈａｏｇｌａｎｄ营养液，幼苗生长至一叶一心期（约１０ ｄ）时用０．４ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ溶液浇灌，持续处理３ ｄ，以不含ＮａＣｌ溶液浇灌为对照。每处理进行３次重复。盐胁迫处理３ ｄ后取样，测定ＰＯＤ的活性并分析其同工酶酶谱变化情况。
　　１．２．２ＰＯＤ活性测定各称取小麦幼苗的根和叶０．５ ｇ，加入２ ｍＬ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ液（ｐＨ值７．８，内含０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ和１％ ＰＶＰ），冰浴研磨至匀浆，再加入ＰＢＳ液冲洗２～３次，使最终体积为
　　５ ｍＬ，匀浆液于４ ℃下１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取出上清液，即为酶提取液，用于ＰＯＤ活性测定和ＰＯＤ同工酶电泳。
　　酶活性的测定反应混合液为：０．０５ ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液５０ ｍＬ（ｐＨ值７．８），３０％ Ｈ２Ｏ２ ０．０２８ ｍＬ，０．２％愈创木酚０．０１９ ｍＬ。取３ ｍＬ反应混合液，加入０．１ ｍＬ酶液，于２５ ℃条件下反应３ ｍｉｎ。在４７０ ｎｍ下读数，每隔１ ｍｉｎ读取１次，共记录４次数据，取平均值；以每分钟ＯＤ470变化０．０１为１个ＰＯＤ活性单位。计算公式如下［１３］：酶活性＝ΔＯＤ470×Ｄ／０．０１×ＦＷ×ｔ。ΔＯＤ470为反应时间内吸光度的变化值；ＦＷ为植物鲜重（ｇ）；ｔ为反应时间（１ ｍｉｎ），Ｄ为稀释倍数，酶活单位为Ｕ／（ｇ・ｍｉｎ）。
　　１．２．３ＰＯＤ同工酶电泳ＰＯＤ同工酶电泳采用北京六一垂直板电泳槽进行。分离胶浓度１０％，浓缩胶浓度４％。在浓缩胶中稳定电压为９０Ｖ，进入分离胶后稳定电压为２００Ｖ，３～４ ｈ完成电泳。同工酶电泳的染色参照醋酸－联苯胺法染色［１４］。将显色后的胶板浸入水中，次日用数码相机拍照，进行分析。
　　２结果与分析
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　　由图１可知，盐胁迫处理后，４个小麦品种的幼苗根和叶中的ＰＯＤ活性均高于对照的小麦幼苗根和叶片中的ＰＯＤ活性；表明４个小麦品种的根部或叶片在经过了高浓度的盐胁迫处理后，ＰＯＤ活性都有不同程度的增强。由图１还可发现，不论是盐胁迫处理还是对照的各品种小麦，幼苗根部的ＰＯＤ活性均高于叶中的ＰＯＤ活性。
　　
　　
　　２．２盐胁迫对小麦幼苗ＰＯＤ同工酶的影响
　　盐胁迫后，４种小麦幼苗的ＰＯＤ同工酶酶谱见图２。由图２可知，ＰＯＤ同工酶酶谱在不同小麦品种间的不同组织中存在差异性，根中的ＰＯＤ同工酶酶带总体染色比叶中的深。根据酶带的集中程度和迁移率的大小，可将酶带分为Ａ、Ｂ、Ｃ等３个区。Ａ区有１条主带，Ｂ区有２条主带，Ｃ区有２条主带；其中Ｂ区、Ｃ区的条带染色较深属于强带，Ａ区的条带染色较浅属于弱带。与对照相比，盐胁迫处理后，各品种小麦幼苗根和叶中的ＰＯＤ同工酶酶带均有不同程度增强；烟辐１８８经盐胁迫处理后，根较对照根的ＰＯＤ同工酶的条带数及着色程度均显著增加；濮麦９号经盐胁迫处理后，叶较对照叶的ＰＯＤ同工酶的条带数及着色程度也明显增加。
　　３讨论
　　植物体内各细胞、组织、器官的基因组成完全一致，但基因的表达存在时间、空间上的差异。同工酶是基因表达的产物，它是生物体为适应细胞代谢的多方面要求而形成的。在生长发育过程中，受到盐胁迫时，植物会从代谢的不同层次和水平上作出相应的应答，在遗传上则表现为基因表达的改变。盐胁迫时，在细胞内代谢产物的诱导或阻遏作用下，诱导有关基因的表达而相应地关闭某些基因，以适应盐胁迫下细胞内的特殊代谢反应。本研究发现，盐胁迫后４个小麦品种幼苗根部和叶中部分酶带明显增加，表明了盐胁迫下ＰＯＤ同工酶基因表达发生了明显的变化，诱导产生了新的同工酶，这可能是植物体通过控制基因的转录、翻译影响表达，从而达到植物体对逆境的抵抗作用，提高植物的抗逆性。
　　幼苗阶段是植物对外界逆境较为敏感的时期，也是植物一生最关键的时期，直接影响植物的形态建成和果实产量。植物在逆境胁迫，如盐胁迫下会产生大量的活性氧，包括羟自由基、超氧阴离子和Ｈ2Ｏ2等，会对细胞造成损伤，如氧化性很强的羟自由基会引发或加剧膜脂质过氧化产生丙二醛（ＭＤＡ），从而造成细胞膜系统损伤，使膜透性增高。因此，植物体会应激地产生有效的保护酶系统和自由基清除剂，以清除这些有毒物质。一般认为ＰＯＤ、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和过氧化氢酶（ＣＡＴ）是植物酶促反应体系的保护酶，它们协同作用，防御活性氧对细胞造成伤害，抑制膜脂质过氧化，以减轻逆境对植物体的伤害［１５］。贺岩等［１６］研究了不同基因型小麦对盐胁迫的不同反应机制，结果表明，盐胁迫严重抑制了小麦植株生长，降低了种子的萌发率，且盐胁迫后，ＰＯＤ活性增加，由脂质过氧化所形成的ＭＤＡ积累缓慢，细胞膜受到的损伤较小，并推测ＰＯＤ可能是耐盐小麦体内清除活性氧自由基的一种重要的保护酶。本研究结果表明，经０．４ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ处理后，通过ＰＯＤ活性检测分析，４种小麦幼苗的根和叶中ＰＯＤ活性显著增加；通过ＰＯＤ同工酶电泳分析，４个小麦品种幼苗处理后的酶带数目和着色程度有不同程度增加。本试验的研究结果进一步证实了ＰＯＤ可能在小麦耐盐机制中参与一定的生理功能，研究其机理为进一步提高小麦的抗盐性，筛选小麦抗盐品系有一定意义。本研究只是从ＰＯＤ一个指标来看，植物的抗盐机理是十分复杂的，还应参考ＳＯＤ、ＣＡＴ等其他方面的数据。
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