[ＲＮＡｉ抑制肝星状细胞ＴＩＭＰ－Ｉ基因表达及对细胞生物学行为的影响]哪些方法可以抑制细胞的基因表达

　　摘　要：研究了siRNA对大鼠肝星状细胞(CFSC)TIMP-I基因表达及对细胞生物学行为的影响，用RT-PCR方法获得带有T7启动子的TIMP-I全基因序列，体外转录法获得TIMP-1dsRNA，Diccr酶切后得到siRNA，用质脂体将siRNA转染至CFSC，RT-PCR检测TIMP-I mRNA的表达，MTT方法检测细胞生长，流式细胞仪检测细胞凋亡，结果成功获得TIMP-I siRNA，将TIMP-I siRNA转染至CP5C 12、24、48 h后，与对照相比，TIMP-I mRNA的表达逐渐下降，经OuanitY Onc(BIO-RAD，USA)分析后，其抑制率分别为49.18％、58.72％和64.73％；siRNA转染CFSC细胞后，CFSC生长受到抑制，细胞凋亡不明显，实验结果表明体外转录法得到的siRNA能有效地降低大鼠CFSC中TIMP-I的表达，明显抑制CFSC的增殖，但不直接引起CFSC的凋亡。
　　关键词：RNAi；基质金属蛋白酶组织抑制因子-1；肝星状细胞；细胞凋亡
　　中图分类号：R34　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0342-06
　　
　　基质金属蛋白酶组织抑制因子－1(TIMP-1)是近年发现的一种由巨噬细胞和结缔组织细胞产生，可抑制基质金属蛋白酶(MMPs)活性的糖蛋白，其分子质量为20kD，由207个氨基酸组成，TIMP-1广泛存在于组织和体液中，但在正常肝组织中却很少表达，在发生肝纤维化时，肝组织中TIMP-I基因表达水平随着肝纤维化程度的加重而增加，当肝纤维化的逆转时其表达水平下降，可见了IMP-1对肝纤维化的维持起着重要的作用，目前抑制TIMP-I基因在肝纤维化组织中的表达已经成为抗肝纤维化研究热点之一，本研究采用RNAi技术，抑制了大鼠肝星状细胞中TIMP-I基因表达，并探讨TIMP-I基因表达受到抑制后对CFSC的增殖与凋亡影响，为肝纤维化的治疗提供新的治疗手段。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1．1　主要材料
　　1．1．1　载体、细胞和菌株 pGEM-T载体购自Promega公司，肝星状细胞系(CFSC)由上海长征医院馈赠，E.coli JMl09购自TaKaRa公司。
　　1．1．2　主要试剂
　　RT-PCR kit、Trizol试剂为Invitrogen公司产品 ;RNAMaxx high yield transcription kit,Recombi-nant Dicer Enzyme kit，GeneEraser siRNA Transfe-ction Reagent kit均为Stratagene公司产品；AnnexinV，FITC细胞凋亡检测试剂盒为北京宝赛公司产品、四甲基偶氮唑(MTT)为Sigma公司产品。
　　
　　1．2　方法
　　1．2．1　总RNA的提取及RT-PCR法获得TIMP-I目的基因
　　从-80℃冰箱中取8周大鼠冰冻肝组织(用本室已构建的大鼠肝纤维化模型)100mg，放入匀浆器中，按说明书用Trizol试剂提取总RNA，-20℃保存，Primer premier 5.0引物设计软件自行设计并由上海博亚生物技术有限公司合成两对PCR引物，序列如下(划线处为T7启动子部分)：
　　第一对引物
　　Sense primer: 5"-CTFCCAGTAAAGCCTGTGG-3"Antisense primer: 5"-GGGAAGGCTI"CGGGTCAT-3"
　　第二对引物
　　Sense prime: 5"GCGTAATACGACTCACTATAGGC
　　TTCCAGTAAAGCCTGTAG-3"
　　Antisense primer: 5"-GCGTAATACGACTCACTATA
　　GGGGGAAGGCTTCGGGTCAT-3"
　　参照Invitrogen二步法RT-PCR试剂盒说明书，以1μg总RNA为模板进行RT-PCR，循环参数为94℃2min，94℃30s，48℃30s，72℃50s，30个循环，72℃5 min。
　　1．2．2　pGEM-T/TIMP-1重组质粒的构建及鉴定
　　TIMP-I基因的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳回收，在4℃下与pGEM-T载体过夜连接，取10μL连接产物转化JMl09感受态细胞，把转化产物涂布于含氨苄青霉素和IPTG与X-gal的平板上，放置于37℃孵箱中过夜培养，挑选白色单个菌落，经含氨苄青霉素的LB液体培养孵育12h后，取质粒DNA，进行PCR并用琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送上海博亚公司测序。
　　1．2．3　PCR法获得带有T7启动子的TIMP-I目的片段
　　用带有T7启动子的引物，以重组质粒pGEM-T/TIMP-I为模板，进行PCR扩增，循环参数为：94℃ 2min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃45s，25个循环，72℃5min。
　　1．2．4　体外转录法获得TIMP-IdsRNA
　　按Stratagene’s RNAMaxx high yield transcrip-tion kit提供方法进行转录，加入25μL无菌DEPC-H2和25μL LiCl沉淀试剂到转录产物中，并快速涡旋；-20℃冷冻30min后，4℃、1000g离心15min；小心弃上清，加入1mL乙醇清洗沉淀，室温、12000g离心10min；弃上清，让沉淀在空气中干燥，用DEPC-H2O重溶dsRNA；最后采用甲醛变性电泳检验反应产物，
　　1．2．5　Dicer酶切TIMP-I dsRNA获得TIMP-I siRNA
　　采用Stratagene公司的Recombinant DicerEnzyme kit提供的方法操作，将2μL 5×Dicerreaction buffer、2μL Recombinant Dicer enzyme(0.5U/μL)、1μL dsRNA(1μg)、5μL Distilledwater混合样品后，37℃温育19h。
　　1．2．6 细胞培养及转染
　　采用Stratagene公司GeneEraser siRNATransfection Reagent kit提供的方法操作，转染前24h，铺CFSC至6孔板，细胞数为每孔2×104/个，待细胞密度达40％～70％时进行转染，将200μL无血清、无抗生素培养基和6μL转染试剂加入到离心管中，涡旋混合后，室温温育10min；再加入10μL siRNA到上述稀释的转染试剂中，轻弹混匀后，室温孵育10min；弃培养基，向6孔板中加入2 mL完全培养基；将转染混合液滴到细胞上，轻轻摇晃孔板，放于CO2孵箱中培养，并分 别于12、24、48 h后进行检测。
　　1．2．7　RT-PCR检测TIMP-I基因表达
　　去除转染后的培养液，加入1mL Trizol试剂，提取总RNA，RT-PCR扩增目的基因，具体方法同前。
　　1．2．8　MTT法检测CFSC增殖
　　CFSC细胞按每孔1×104个接种于96孔板，于37℃、CO2条件下培养24h，每组设6个复孔，分组为：①空白细胞对照组；②转染试剂对照组；③siRNA转染组，操作按试剂书说明进行，每孔加脂质体1μL，其中第③组加入TIMP-I siRNA lμg比例，以转染结束的时间点定为0h，各组继续常规培养，分别于12、24、48 h终止培养，每孔中加MTT 20μL(10g/L)，同样条件下保温4h，弃上清，每孔加入200μL二甲基亚矾(DM-SO)，混匀，在酶标仪上测定波长570nm处吸光度(A)值，计算各时间点CFSC的存活抑制率，实验重复2次。
　　1．2．9　流式细胞仪检测细胞调亡
　　参照AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书，把转染后的细胞制成单细胞悬液并固定，并用流式细胞仪进行检测。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果
　　从图l中可以看出所扩增的片段在500～700bp之间，与目的条带的长度578 bp一致，
　　
　　2．2　pGEM-T/TIMP-I重组质粒的构建及鉴定
　　pGEM-T/TIMP-T重组质粒经PCR鉴定后，所得片段与RT-PCR相符，经测序，所获得的目的基因与GenBank报道结果完全一致，说明成功构建pGEM-T/TIMP-1重组质粒，为进一步获得TIMP-I的dsRNA奠定了基础(见图2)。
　　　
　　2．3 带有T7启动子的目的基因的获得及结果
　　以重组质粒pGEM-T/TIMP-I为模板，进行PCR扩增带有获得T7启动子的目的基因，从图3中可见600bp处有一条清晰目的基因条带，与目的条带的长度618bp一致。
　　　　
　　2．4　甲醛变性电泳检测结果
　　将体外转录法获得的TIMP-I的dsRNA进行甲醛变性电泳，由图4可见琼脂糖凝胶中显示清晰的目的基因条带。
　　　　
　　2．5　TIMP-I siRNA转染CFSC后RT-PCR检测TIMP-1 mRNA的表达
　　从图5可以看出经体外Dicer酶切得到的siRNA转染CFSC 12、24、48 h后TIMP-I mRNA的表达逐渐下降，经Quality One(BIO-RAD，USA)分析后，其抑制率为49.18％、58.72％和64.73％。
　　
　　2．6　MTT法检测细胞增殖结果
　　如(表1)所示，实验组48h的OD值高于细胞对照组，差异有统计学意义，P＜0.05，根据OD值绘制的生长曲线表明，TIMP-I siRNA转染CFSC后48h，可检测到细胞增殖降低(图6)。
　　　　
　　2．7　流式细胞仪检测细胞调亡结果
　　如图7所示，流式细胞仪检测结果中右下象限为细胞早期调亡的数量，从图7中可以看出转染siRNA后的CFSC早期凋亡的数量在12，24，48h与对照组细胞相比较，无明显差异。
　　
　　3　讨论
　　
　　3．1　TIMP-1在肝纤维化中的作用
　　肝纤维化的发生是由于多种因素的相互作用，导致细胞外基质(ECM)在肝内大量堆积，原因之一是组织内金属基质蛋白酶(MMPs)活性降低，从而阻止了ECM的降解，使ECM正常转换发生障碍，肝脏受损后，一方面ECM合成增多，另一方面金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)表达上调，发挥对MMPs的普遍抑制作用，使ECM降解减少，沉积增多，最终导致肝纤维化的形成，肝纤维化与肝星状细胞的活化也存在密切的关系，肝纤维化时肝星状细胞发生表现型的改变，称为“活化”，肝脏肝星状细胞活化伴随着一系列的功能改变，主要包括合成大量细胞外基质、细胞增殖明显、分泌趋化性因子及细胞因子、细胞外基质降解酶合成异常等，这些功能的改变决定了其在肝纤维化形成中的关键作用，TIMP-I是肝纤维化发生过程中的关键分子，它在肝组织中持续表达的增高可能是维持肝星状细胞活化或抑制其凋亡的关键因素，而设法降低TIMP-I在活化的肝星形细胞中的表达已成为抗肝纤维化的研究热点之一，目前，反义核酸技术等基因阻断技术已应用到肝纤维化的基因治疗中，但效果不十分理想。
　　
　　3．2 RNA干扰技术的选择
　　RNA干扰是新的基因阻断技术，是由双链siRNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因的表达，是序列特异性的转录后基因沉默，具有高效、特异、简单等特点，目前获得siRNA的方法主要有：体外转录法、化学合成法、载体表达法等，本研究采用体外转录法获得siRNA，该方法与其他方法相比较，可大量、快速制备目的siRNA，并能省去大量的筛选工作。
　　
　　3．3　TIMP-1与肝星状细胞增殖及凋亡的关系
　　由于活化的肝星状细胞具有增殖明显的特征，其数量的增多，也会导致ECM的增加而造成肝纤维化，因此，抑制活化的肝星状细胞的增殖，对肝纤维化的治疗也具有重要意义，本研究用TIMP-I siRNA转染CFSC后通过MTT实验发现细胞生长受到抑制，表明沉默TIMP-1的基因表达能够抑制细胞的增殖。活化的肝星状细胞的凋亡是一个非常复杂的过程，涉及多种因素及细胞因子的相互作用，肝星状细胞活力维持，与这些因子的作用有密切关系，本研究应用RNAi技术将TIMP-1 siRNA转染肝星状细胞12、24、48h后，发现随着培养细胞的时间增加TIMP-1mRNA表达逐渐降低，同时用流式细胞仪检测早期凋亡的结果显示细胞凋亡数量不明显，分析的原因可能为参与到肝星状细胞的激活、转化及调节的细胞因子可多达几十种，因此，体外培养的肝星状细胞中单独降低了TIMP-I的表达可能不一定会直接引起其凋亡。
　　
　　作者简介：徐华锋(1971―)，男，黑龙江哈尔滨人，博士研究生，讲师，主要从事生物大分子结构和功能关系的研究；于晓光(1963―)，女，黑龙江哈尔滨人，哈尔滨医科大学教授，博士生导师，通讯作者，主要从事生物大分子结构和功能关系的研究。