[ＫＬＦ４过表达对ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞和Ｃ２Ｃ１２肌原细胞增殖的影响] 巨噬细胞红蓝铅笔图

　　摘　要：为探讨Kruppel样因子4(Kruppel-like faetor4，KLF4)过表达对RaW264.7巨噬细胞和C2C12小鼠肌原细胞生长的影响，采用脂质体转染KLF4的真核表达质粒于RaW264.7巨噬细胞和C2C12，细胞中，G418筛选阳性克隆，western blotting鉴定高表达克隆；观察各转染细胞生长情况，CCk-8法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期分布，凋亡百分率，发现与空质粒转染细胞相比，KLP4过表达对Raw264.7巨噬细胞的生长曲线、细胞周期分布、凋亡百分率没有明显的影响，而C2C12细胞生长速度减慢，细胞凋亡百分率明显高于空载体组，上述结果表明KLF4基因对Raw264.7巨噬细胞增殖没有明显影响，而对C2C12细胞增殖起负调控作用。
　　关键词：KLF4；基因转染；R8w264.7细胞；C2C12细胞；细胞增殖
　　中图分类号：R361　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0263－05
　　
　　Kruppel样因子4(Kruppel-1ike factor4，KLF4)是Sp/Kdlppel样锌指转录因子家族的成员之一，这个家族目前已发现20多个成员，如Spl-4、KLPl-14等，Sp/Kruppel样因子是机体内一类具有重要功能的蛋白质，它们参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育等重要生命过程，并与肿瘤等多种疾病有关，研究表明，KLF4在胚胎发育晚期及肠管分化终末期的上皮细胞中其表达均增高，提示KLF4具有抑制某些细胞增殖的功能，为了深入探讨KLF4的功能，本研究室建立了稳定高表达该基因的Raw264.7小鼠巨噬细胞株和C2C12小鼠肌原细胞株，在此建株过程中，我们发现转染KLF4对上述两种细胞增殖的影响明显不同。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　材料
　　Raw264.7巨噬细胞株购自上海细胞中心；C2Cn小鼠肌原细胞由本校细胞中心提供：DMEM及RPMI-1640培养基购自Gibeo公司；G418购自Promega；无支原体小牛血清，杭州四季青生物工程公司产：丙烯酰胺、N，N′2亚甲基双丙烯酰胺购自Fluka公司；二硫苏糖醇(DTT)、过硫酸胺、TEMED、硝酸纤维素膜购自Promega公司；Lipo-feetamineTM 2000、真核表达载体质粒pcDNA3.1购自Invitrogen life technologies公司：peDNA3.1-KLF4重组质粒本室构建；兔抗KLF4多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG及DAB显色试剂盒购自博士德生物工程有限公司：CCK-8溶液由日本同仁化学株式会社提供。
　　
　　1．2　方法
　　1．2．1　KLF4过表达细胞株的建立
　　利用脂质体介导的转染技术(根据Invitrogenlife technologies公司提供的转染操作说明书进行操作)将空载体pcDNA3.1和重组质粒pcDNA3.1-KLF4导人Raw264.7和C2C12细胞中，根据本室以往所建立的方法筛选过表达细胞株。
　　1．2．2　免疫印迹分析
　　按《分子克隆实验指南》所载方法进行，用1×SDS加样缓冲液裂解细胞，收集细胞蛋白质，采用Bradford法进行蛋白定量。制备好的蛋白样品置，80℃冰箱保存备用，每泳道上样30μg蛋白，经10％SDS-PAGE(70V，120V分别电泳2h和4h左右)电泳后，电转膜至硝酸纤维膜，室温封闭后加入兔抗KLF4多克隆抗体，室温孵育2h，加入HRP标记的羊抗兔IgG孵育1h，DAB显色，拍摄照片，记录试验结果。
　　1．2．3　细胞形态观察
　　取各转染细胞于倒置显微镜下，观察其生长速度和形态改变，并逐日记录。
　　1．2．4　CCK-8法检测细胞的增殖
　　取生长状态良好的对数生长期各组细胞接种于96孔板(每孔1×104个细胞)，每组接种5个复孔，在含10％新生小牛血清的条件下分别培养24h，48h及72h后加入CCK-8溶液10μL继续培养4h，将96孔板放人酶标仪，在450nm波长处测定各孔OD值。
　　1．2．5　流式细胞术检测
　　本实验由北京鼎国生物技术公司协助完成，分别接种等量的对数生长期的各组细胞于100mL培养瓶中，每组5瓶，培养24h后，参考该公司流式细胞检测说明收集细胞，送北京鼎国生物技术有限公司进行流式细胞术分析。
　　1．2．6　统计学处理
　　数据以均数土标准差(x±s)表示，两组间比较用t检验分析，以P＜0.05判断为有统计学意义。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　Western blotting筛选高表达KLF4的细胞克隆
　　采用脂质体分别转染KLF4的真核表达质粒pcDNA3.1-KLF4和空载体pcDNA3.1至Raw264.7和C2C12，细胞中，经G418筛选后，利用KLF4多克隆抗体进行Western印迹分析，鉴定高表达克隆，结果显示，筛选到高表达克隆，在两种细胞株中KLF4蛋白表达量较转空载体组明显增加(图1)。
　　
　　2．2　细胞生长情况
　　2．2．1　KLF4过表达对细胞形态的影响
　　KLF4过表达的Raw264.7细胞形态无明显变化，C2C12空载体组贴壁细胞主要呈长梭形，极向或交叉排列，部分KLF4基因过表达的细胞形态发生改变，如细胞向多角形转变，细胞形状多样等(见图2)。
　　
　　2．2．2　CCK-8法结果
　　Raw264.7的空载体组和KLF4组之间细胞增殖能力无明显变化(p＞0.05)(表1)，C2C12的KLF4组与其空载体组相比较，细胞增殖能力降低(p＜0.05)(表2)。
　　
　　2．2．3　流式细胞术分析KLF4对细胞周期及细胞凋亡的影响
　　利用流式细胞术检测了Raw264.7-pcDNA3.1、Raw264.7-KLF4，C2C12-pcDNA3.1及C2C12-KLF4 4组细胞的周期分布及凋亡百分率，结果显示转染空载体和KLF4过表达对Raw264.7细胞的细胞周期分布及细胞凋亡无明显影响(P＞0.05)；与转 空载体的C2C12相比较，KLF4过表达的C2C12细胞中处于S期的细胞减少，而G1期的细胞相应增多(图3)，凋亡细胞也增多(P＜0.05)(图4)。
　　 　　
　　3　讨论
　　
　　KLF4是Kriippel样锌指转录因子家族的一个重要成员，小鼠KLF4蛋白全长包含483个氨基酸残基，分子质量为53kD，和人的KLF4蛋白具有90％的相似性，KLF4蛋白的羧基端具有3个连续的C2H，锌指结构，这3个锌指的结构均符合保守序列：CX2-4CX3FX5LX2HX3H；两个锌指结构之间由一个7个氨基酸残基的H/C连接序列连接，该连接序列为了GEKP(Y/F)X，KLF4能够对角蛋白4(keratin)、肠碱性磷酸酶(intestinalalkaline phosphatase，IAP)、鸟氨酸脱羧酶(omithine decarboxylase，ODC)、β链蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和组氨酸脱羧酶(histidine decarboxylase，HDC)等多个启动子的转录活性进行调控，从而在机体的生长和发育过程中起着重要的调节作用，对KLF4的研究最初是从胃肠道开始研究的，它的表达在生长抑制的状态下明显增高：此后的研究发现，KLF4除了在肠的不同组织中表达外，还在表皮有高水平的表达并在皮肤表皮细胞分化晚期起重要作用；KLF4缺失能导致皮肤屏障功能障碍从而使新生小鼠在出生后短时间内死亡，此外，最近的研究还表明，KLF4在精子细胞及其支持细胞的终末分化过程中出现高表达，这说明KLF4可能在哺乳动物睾丸发育过程中起到重要作用，但是，KLF4对Raw264.7细胞和C2C12细胞增殖的影响，目前尚未见报道。
　　为了阐明KLF4对Raw264.7细胞和C2C12细胞增殖的影响，本研究分别建立了KLF4过表达的Raw264.7和C2C12细胞株，并采用多种方法共同检测了KLF4过表达对该两种细胞增殖的影响，结果显示，KLF4过表达对Raw264.7细胞的形态和增殖无明显影响：而KLF4过表达的C2C12细胞株中，多角形的细胞增多，细胞周期中S期的细胞相对减少，细胞增殖速度明显减慢，由此可见，KLF4对这两种细胞增殖的影响具有显著的细胞差异性。
　　KLF4在细胞内的调节机制非常复杂，Jun-ichi okano等发现，KLF4可以结合对角蛋白4启动子上CACCC盒而激活之，角蛋白4在细胞分化和细胞骨架构成中具有重要作用；小分子cyclin D1启动子也包含多个CACCC元件，KLF4在体外能够与其相结合并能够在体内抑制该启动子的转录活性，实验证明，KLF4也能够与p300和CBP相互作用，从而实现其生长抑制功能，KLF4还可能是通过乙酰化来逆转其与其他蛋白的相互作用，KLF4在C2C12细胞内是否也通过上述途径调节C2C12细胞，导致C2C12细胞生长减慢，具体机制还有待进一步研究，总之，KLF4的转录调控机制很复杂且对选择性的修饰和蛋白间相互作用很敏感，在一个完整的细胞周期中，KLF4起着多重的关键性作用。
　　
　　作者简介：刘梅冬(1970－)，女，湖南耒阳人，中南大学实验师，主要从事心血管内源性保护的机制研究；刘瑛(1977－)，女，河南焦作人，中南大学讲师，博士，通讯作者，主要从事心血管内源性保护的机制研究。