[棉花热激处理和施用脱落酸的效应]脱落酸是什么

　　摘要：采用人工气候箱，研究了热激萌动种子（４２℃、２ｈ）、脱落酸（ＡＢＡ）（１×１０－５ｍｏｌ/Ｌ）浸种（６ ｈ）、２叶期叶面喷施和根部灌施，对棉苗抵御（模拟）高温干旱逆境能力的影响。结果表明，在高温干旱期间，与对照相比，所有处理都合成了差异蛋白质，但ＡＢＡ浸种所合成的热激蛋白（ＨＳＰ）更丰富。另外，所有处理都显著提高了棉苗超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性；ＡＢＡ浸种、根部灌施处理和热激处理还显著提高了棉苗过氧化物酶（ＰＯＤ）活性；ＡＢＡ叶面喷施处理和热激处理显著提高了棉苗过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性。ＡＢＡ叶面喷施处理和浸种处理降低了棉苗丙二醛（ＭＤＡ）含量。
　　关键词：棉花；脱落酸；热激；抗氧化酶
　　中图分类号：Ｓ５６２；Ｑ９４５．７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2828-03
　　
　　Effect of Heat Shock and ABA Application on Cotton Seedlings
　　
　　ＣＨＥＮ Ｙｕ－ｌｏｎｇ，ＣＨＥＮ Ｑｉｕ－ｚｈｕ，ＹＡＮＧ Ｇｕｏ－ｚｈｅｎｇ，ＣＨＥＮ Ｌｉａｎｇ，ＺＨＵ Ｚｈｅｎ－ｚｈｅｎ，ＳＯＮＧ Ｘｕｅ－ｚｈｅｎ，
　　ＷＡＮＧ Ｄｅ－ｐｅｎｇ，ＢＡＴＡＵＮＧ Ｍ
　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｍｂｅｒ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｏｎ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｅｄｓ （４２℃，２ｈ）， ＡＢＡ （１×１０－５ｍｏｌ/Ｌ） ｓｏａｋｉｎｇ ｓｅｅｄｓ （６ ｈ）， ｉｒｒｉｇａｔｉｎｇ ｒｏｏｔｓ （５ ｍL １×１０－５ｍｏｌ/Ｌ ＡＢＡ ｐｅｒ ｐｌａｎｔ） ａｎｄ ｓｐｒａｙｉｎｇ ｏｎ ｌｅａｆ （５ｍL １×１０－５ｍｏｌ/Ｌ ＡＢＡ ｐｅｒ ｐｌａｎｔ） ａｔ ２－ｌｅａｆ ｓｔａｇｅ ｏｎ ｃｏｔｔｏｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｎｄｅｒ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ （３５ ℃） ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｄｅｆｉｃｉｔ （４ ｄ ｏｆ ｄｒｙｉｎｇ） ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ， ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｒｏｕｇｈｔ ｐｅｒｉｏｄ， ｃｏｔｔｏｎ ｐｌａｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ＨＳＰ， and the HSPs were more abundant ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏａｋｉｎｇ ｓｅｅｄ ｗｉｔｈ ＡＢＡ． Ａｌｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｔｈｅ ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ． Ｈｅａｔ sｈｏｃｋ， ｓｏａｋｉｎｇ ｓｅｅｄ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡＢＡ ａｌｌ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＯＤ． Ｈｅａｔ sｈｏｃｋ ａｎｄ ＡＢＡ ｌｅａｆ ｓｐｒａｙｉｎｇ ａｌｓｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＡＴ． Ｂｅｓｉｄｅｓ， ｓｏａｋｉｎｇ ｓｅｅｄ ａｎｄ ｌｅａｆ ｓｐｒａｙｉｎｇ ｗｉｔｈ ＡＢＡ ｌｏｗｅｒｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＭＤＡ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｔｔｏｎ； ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ （ＡＢＡ）； ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ
　　
　　脱落酸（ＡＢＡ）能够提高植物体的抗逆性。植物体内存在一个逆境反应系统，不同的逆境条件可能诱导不同的信号传导系统，而ＡＢＡ被认为是一种重要逆境胁迫激素［1－4］。热激蛋白（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＨＳＰ）是指生物体受到高温、缺氧、饥饿、重金属离子等不良环境因素影响时诱导合成的一类应激蛋白，存在于胞质溶胶、线粒体、叶绿体和内质网等不同部位。近２０多年来，已发现在热激条件下，大豆、玉米、棉花、大麦、番茄、烟草、油菜和水稻等都能诱导合成热激蛋白，热应激研究已成为植物生物工程中较为活跃而且是发展较快的领域之一。HSP可提高细胞的耐热性（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ），ＨＳＰ的生成量与生物耐热性呈正相关。因此认为，ＨＳＰ可提高细胞的应激能力。当细胞受热或受其他外界应力刺激时，能获得抗性以保护细胞免受损伤。因此，研究ＡＢＡ和热激预处理后，在高温干旱条件下，棉苗体内HSP的合成及相关抗性酶活性的适应性变化，对于探讨逆境预处理的免疫效应和提高棉苗抗逆能力，保证棉花一播全苗、打下丰产基础具有重要的意义。
　　１材料与方法
　　１．１棉苗培养方法
　　２００５年以ＤＰ９９Ｂ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）为试验材料，设置１×１０－５ｍｏｌ／Ｌ ＡＢＡ浸种、三叶期叶面喷施、根部灌施、热激和对照５个处理，三次重复。用１×１０－５ｍｏｌ／Ｌ ＡＢＡ浸种６ ｈ后播种（ＡＢＡ浸种前，用清水在２８ ℃下浸种１２ ｈ），热激处理用４２ ℃、２ ｈ［5］处理萌动的棉花种子后播种，ＡＢＡ叶面喷施处理和ＡＢＡ根部灌施处理， 在棉苗生长到三叶期时进行。
　　试验棉苗在华中农业大学植物科学技术学院中心实验室的人工气候室内培养，培养温度为２８ ℃，日光灯提供光照，光周期为光期１４ ｈ、暗期１０ ｈ。在装有蛭石的塑料杯（H为９ ｃｍ、Φ上为７ ｃｍ、Φ下为５ ｃｍ）中培养棉苗。每杯装蛭石６０ｇ，播种后总重７８ ｇ，再浇水４０ ｍＬ。待棉苗长出后，每杯留两株苗，每４天给培养苗浇水３０ ｍＬ（其中，棉苗一叶期浇完全培养液），各培养杯在托盘内随机摆放，以保证每个处理处于相同的培养条件下。
　　１．２可溶性蛋白质提取
　　棉苗三叶期时，开始叶面喷施脱落酸（每杯１０ ｍＬ １×１０－５ｍｏｌ/Ｌ ＡＢＡ液）、根部灌施脱落酸（每杯５ ｍＬ １×１０－５ｍｏｌ/Ｌ ＡＢＡ液），然后置于高温干旱条件下（温度３５ ℃、４ ｄ左右不浇水）。取叶片１ ｇ，加３ ｍＬ提取液于研钵中，提取可溶性蛋白质［6］。叶片研磨提取过程在冰浴上进行，静置１０ ｍｉｎ，然后在４℃ １０ ０００ ｒ/ｍｉｎ条件下离心２０ ｍｉｎ，所得上清液即为蛋白质粗提液。
　　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳参考Ｌａｅｍｍｌｉ的垂直板进行［7］。电泳凝胶用银染法染色，以分辨不同蛋白质种类，银染按Ｔｈｅ ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔTM Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ提供的方法进行。采用Ｇｅｎｅ Gｅｎｉｕｓ Bｉｏ-ｉｍａｇｉｎｇ Sｙｓｔｅｍ （Ｓｙｎｇｅｎｅ，Ａ Dｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）分析蛋白质分子量和含量。
　　１．３超氧岐化酶（ＳＯＤ）活性测定
　　采用氮蓝四唑（ＮＢＴ）测定法。０．０５ ｍｏｌ/Ｌ磷酸缓冲液（ＰＢＳ），ｐＨ值７．８作提取液，冰浴研磨，４ ℃下１０ ０００ ｒ/ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，所得的上清液即为ＳＯＤ粗提液。反应体系包括：０．０５ ｍｏｌ/Ｌ ＰＢＳ １．５ ｍＬ，１３０ ｍｍｏｌ／Ｌ蛋氨酸（Ｍｅｔ）０．３ ｍＬ，７５０ ｍｍｏｌ/Ｌ ＮＢＴ ０．３ ｍＬ，１００ ｍｍｏｌ/Ｌ乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ－Ｎａ２）０．３ ｍＬ，２０ μｍｏｌ/Ｌ核黄素０．３ ｍＬ，酶液０．１ ｍＬ，去离子水０．２ ｍＬ，置于光下反应３０ ｍｉｎ。ＳＯＤ活性以抑制ＮＢＴ光化还原的５０％为一个酶活性单位来表示［8］。
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　　紫外分光光度法测定。提取方法同ＳＯＤ。其反应体系为０．２％ Ｈ２Ｏ２ １.0 ｍL，去离子水１．９ ｍL，最后加入０．１ ｍL酶液启动反应，测定２４０ ｎｍ处的A值降低程度。将每分钟A值减少０．０１定义为１个酶活性单位［9］。
　　１．５过氧化物酶（ＰＯＤ）活性测定
　　愈创木酚法测定。酶液的提取同ＳＯＤ的提取方法。其反应体系为０．２％ Ｈ２Ｏ２ ２．００ ｍＬ，０．２％愈创木酚０．９５ ｍＬ，ＰＢＳ（ｐＨ值７．０）１．００ ｍＬ，最后加入０．０５ ｍＬ酶液启动反应，记录A值增加的速度［8］。
　　１．６丙二醛（ＭＤＡ）含量测定
　　硫代巴比妥（ＴＢＡ）法测定。以５０ ｍｍｏｌ/Ｌ磷酸缓冲液（ＰＢＳ，ｐＨ值７．０）在冰浴中提取，４ ℃时以
　　１０ ０００ ｒ/ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，上清液即为丙二醛粗提液。反应体系包括０．５％硫代巴比妥（ＴＢＡ）２．５ｍＬ，酶液１．５ ｍＬ，混合后在沸水浴中煮１５ ｍｉｎ，冷却后，分别测定酶液在４５０、５３２和６００ ｎｍ处的吸光度，按公式Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）＝６．４５×（Ａ５３２－Ａ６００）－０．５６×Ａ４５０计算出ＭＤＡ浓度，再计算出单位鲜重组织中ＭＤＡ含量（μｍｏｌ/ｇ）［8］。
　　１．７数据分析
　　采用Ｅｘｃｅｌ ２００３作差异显著性检验（ＬＳＤ法）
　　２结果与分析
　　２．１棉苗HSP表达
　　从凝胶泳道上可以清楚地看出，与对照相比（泳道１０、１１），所有处理都合成了非常丰富的ＨＳＰ，尤其以小分子量ＨＳＰ为主（图１）。
　　采用凝胶自动成像系统扫描分析。结果（表１）表明， ＡＢＡ根部灌施处理检测到１１种蛋白质，其中６种ＨＳＰ，关闭了１种蛋白质的合成；ＡＢＡ浸种处理也合成了１１种蛋白质，其中９种ＨＳＰ，关闭了４种蛋白质的合成；热激处理合成了７种蛋白质，其中４种HSP，关闭了３种蛋白质的合成；ＡＢＡ叶面喷施处理检测出５种蛋白质，其中２种ＨＳＰ，同时关闭了３种蛋白质的合成。对照中８７ｋＤ在所有处理中都没有得到表达，说明其与棉苗正常生长发育关系不大；而３０ｋＤ在所有处理中得到了表达，说明其是组成型表达的，与棉苗正常生长发育相关。ＡＢＡ根部灌施处理保留了６种蛋白质的合成，浸种处理保留了２种，叶面喷施处理和热激处理都保留了３种蛋白质。表明不同预处理后，棉苗对次生逆境的反应机制存在一定差异。ＡＢＡ根部灌施处理和浸种处理不但表达了热激处理中所表达的热激蛋白，并且还表达了热激处理中所没有的大分子量蛋白质（＞１００ｋＤ）和中等分子量蛋白质（４０～１００ｋＤ）。
　　从各处理蛋白质的合成量来说，所有对照中合成的蛋白质的合成都受到了不同程度的抑制（除热激处理的１５ｋＤ之外），其中对１７ｋＤ的抑制最强。ＨＳＰ合成量超过１ μｇ／ｇ的有５种，其中含量最高的是ＡＢＡ浸种处理的ＨＳＰ１４ｋＤ，其含量达到４．２４ μｇ／ｇ，其次是ＡＢＡ叶面喷施处理的ＨＳＰ２１ ｋＤ，达到２．３１ μｇ／ｇ，热激处理的ＨＳＰ１４ｋＤ，含量为１．４６ μｇ／ｇ。
　　２．２不同预处理抗氧化酶活性和MDA含量
　　生物体内抗氧化酶活性可以反映其抵御逆境的能力，而ＭＤＡ含量可以间接反映生物体遭受逆境破坏的程度。经受不同形式的逆境预处理之后，棉花幼苗在次生逆境条件下，其体内ＳＯＤ活性，热激处理极显著高于对照，其他处理显著高于对照；ＣＡＴ活性，ＡＢＡ叶面喷施处理极显著高于对照，热激处理显著高于对照，其他处理与对照相当；ＰＯＤ活性，除ＡＢＡ叶面喷施处理与对照相当外，其余处理均显著高于对照；ＭＤＡ含量，ＡＢＡ叶面喷施处理和浸种处理显著低于对照，其余处理与对照相当（表２）。说明亚致死逆境预处理能提高棉苗抗次生逆境的能力。
　　３小结与讨论
　　ＡＢＡ根部灌施处理、浸种处理和热激处理的棉苗在高温干旱条件下，能够表达比对照更多种类的ＨＳＰ。由此可见逆境预处理能够诱导棉苗ＨＳＰ基因的表达。分析测定棉苗在高温干旱条件下叶片内的抗氧化酶活性和ＭＤＡ含量表明，这些被诱导的ＨＳP基因的表达与棉苗在高温干旱条件下的抗性有关。不同处理，棉苗合成的ＨＳＰ种类和数量不同，其中ＡＢＡ浸种处理表达了９种ＨＳＰ，特别是小分子量的ＨＳＰ，而且其ＨＳＰ的量最大。热激处理显著或极显著提高了３种抗氧化酶活性，ＡＢＡ处理（浸种、根部灌施和叶面喷施）都显著提高了至少２种抗氧化酶活性。因此，各处理ＭＤＡ含量显著低于对照或与对照相当。说明逆境锻炼有助于棉苗获得一定的抗逆能力，其机制是通过启动ＨＳＰ基因的表达，提高抗氧化酶活性，保护细胞免受伤害。
　　
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