【家蚕幼虫黄白血液蛋白差异的双向电泳分析】 石蚕幼虫

　　摘要：试验利用黄白茧色限性品种Ｙ９２为材料，在4、5龄幼虫期，测定了黄血蚕（雌）、白血蚕（雄）的血液蛋白质含量的消长变化，幼虫血液蛋白质含量随生长发育逐渐增多，至5龄期第八天到达最高值，黄血蚕９４．３６ μｇ／μＬ，白血蚕５４．８２ μｇ／μＬ。利用双向电泳技术，比较5龄期第六天幼虫黄、白血液的蛋白质差异，在蛋白质电泳图谱中，黄、白血蚕总共检测到５０７个蛋白点，其中黄血蚕有２８７个蛋白点，白血蚕有２２０个蛋白点，两者能匹配的蛋白点有２０５对，匹配率达到８０．９％；特异性蛋白点，黄血蚕有８２个，白血蚕有１５个。
　　关键词：家蚕幼虫；黄白血液；蛋白质；电泳分析
　　中图分类号：Ｓ８８１．２＋４文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）10－2128-03
　　
　　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｙｅｌｌｏｗ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｂｏｍｂｙｘ mｏｒｉ Ｌａｒｖａｅ ｂｙ Ｔｗｏ Ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
　　
　　ＫＯＮＧ Ｑｉｎｇ－mｉｎｇ１，ＺＨＯＮＧ Ｙａｎｇ－sｈｅｎｇ１，ＬＩＮ Ｊｉａｎ－rｏｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｙｅ－yｕａｎ１，ＬＩＮ Ｂｉ－mｉｎ１，
　　ＧＵＯ Ｄｉｎｇ－gｕｏ２，ＬＩＮ Ｚｈｏｎｇ－fｅｎ２
　　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２， Ｃｈｉｎａ；
　　２． Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４０，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｔｈｅ ｓｅｘ－ｌｉｍｉｔｅｄ ｂｒｅｅｄ ｙｅｌｌｏｗ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｃｏｃｏｏｎ ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｉｎ ｔｈｅ ４ｔｈ ａｎｄ ５ｔｈ ｉｎｓｔａｒ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｕｌｅ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｌａｒｖａｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒｏｗｉｎｇ ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ peak ｉｎ ｔｈｅ ８ｔｈ ｄａｙ ｏｆ ｔｈｅ ５ｔｈ ｉｎｓｔａｒ． Ｆｏｒ ｙｅｌｌｏｗ－ｂｌｏｏｄ ｓｉｌｋｗｏｒｍ （ｆｅｍａｌｅ） ｉｔ ｗａｓ ９４．３６ μｇ／μＬ； ａｎｄ ｆｏｒ ｗｈｉｔｅ－ｂｌｏｏｄ ｓｉｌｋｗｏｒｍ（ｍａｌｅ） ｉｔ ｗａｓ ５４．８２ μｇ／μＬ． Ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （２－ＤＥ） ａｎｄ ｇｅｌ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ， ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｌｅ ａｎｄ ｆｅｍａｌｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｓｉｌｋｗｏｒｍ ａｔ ｔｈｅ ６ｔｈ ｄａｙ ｉｎ ｔｈｅ ５ｔｈ ｉｎｓｔａｒ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ５０７ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ２－ＤＥ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｍａｌｅ ａｎｄ ｆｅｍａｌｅ ｂｌｏｏｄ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ２８７ ｂｅｌｏｎｇed ｔｏ ｆｅｍａｌｅ ａｎｄ ２２０ ｂｅｌｏｎｇed ｔｏ ｍａｌｅ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ 205 ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ｍａｔｃｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ２－ＤＥ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ｍａｌｅ ａｎｄ ｆｅｍａｌｅ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｔｃｈ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ａｓ ｈｉｇｈ ａｓ ８０．９％． Ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ８５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｏｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｆｅｍａｌｅ ａｎｄ １５ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｍａｌｅ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｌａｒｖａｅ； ｙｅｌｌｏｗ ａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ； ｐｒｏｔｅｉｎ； ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ
　　
　　家蚕是一种绢丝昆虫，一直是生物学研究的模式昆虫，由于蚕能够泌丝结茧，因而具有很高的经济利用价值。近年，蚕业科技工作者进一步对天然彩色茧丝资源进行了拓展利用，并就彩色茧形成的机理作深入地研究。Ｊｏｕｎｉ等［１］通过硫酸铵沉淀、浓缩和阴离子交换层析等技术，在结黄茧的５龄幼虫中肠中发现了一种叶黄素结合蛋白（ｌｕｔｅｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＢＰ），该蛋白的等电点为５．４，相对分子量３５ ｋＤ。Ｔａｂｕｎｏｋｉ等［２］在家蚕黄茧品种的丝腺组织中分离纯化出一种类胡萝卜素结合蛋白（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＢＰ），并对其进行了ｃＤＮＡ的序列分析，ＣＢＰ的表达由显性的黄血Ｙ基因调控，含２９７个氨基酸残基，大小为３３ ｋＤ，以１∶１的摩尔比结合叶黄素，该蛋白在中肠上皮细胞和中部丝腺内膜中发挥着辅助吸收和再分配类胡萝卜素的功能。Ｔｓｕｃｈｉｄａ等［３］以４种家蚕突变体为材料，通过对脂肪酸转运与代谢的研究，认为家蚕Ｙ基因隐性突变体的血液和蚕茧无色的原因可能是类胡萝卜素的转运与细胞吸收缺陷而引起的。Ｓａｋｕｄｏｈ等［４］对ＣＢＰ在前胸腺的表达分析研究中，分离鉴定了一种新的类胡萝卜素结合蛋白ＢｍＳｔａｒｔ１，ＢｍＳｔａｒｔ１基因与ＣＢＰ正向同源，在家蚕黄、白茧品种中均有表达。随着后基因组时代即功能基因组时期的来临，蛋白质组学（Ｐｒｏｔｏｅｍｉｃｓ）的应用越来越受到重视［５，６］。自从１９９４年Ｗｉｌｋｉｎｓ和Ｗｉｌｌｉａｍｓ第一次提出蛋白质组（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ）的概念以来，蛋白质组学的研究得到了空前的发展，相关技术的研究也取得了重大突破［７，８］。家蚕蛋白质组的研究，科学工作者正以家蚕胚胎、丝腺、血液等组织器官为材料，采用双向电泳分离技术、质谱分析等鉴定技术，开展功能蛋白的探索研究，构筑参考图谱和家蚕蛋白质数据库，查找与生长发育有关的功能蛋白，从而在蛋白质水平上阐明家蚕生长发育、代谢调控等生命活动的规律。与原核生物、酵母、人类的蛋白质组学研究相比，家蚕蛋白质组学还处在发展的初期阶段。为进一步探索家蚕有色茧的形成机制，我们利用双向电泳技术对结黄白茧的家蚕幼虫的黄、白血液蛋白进行电泳图谱的差异分析，查找与茧色素相关联的蛋白。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　供试家蚕品种：Ｙ９２（黄白茧色限性品种），雌蚕黄血结黄茧，雄蚕白血结白茧，由华南农业大学蚕丝科学系提供。
　　１．２材料处理
　　常规饲养Ｙ９２品种至4龄期，从４期开始，每天腹足取血，在血样本中加入微量苯基硫脲防氧化，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４°Ｃ离心２０ ｍｉｎ，取上清，按Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量，分装后置于－８０℃保存。等电聚焦电泳前，根据所测蛋白质含量，将血液与裂解液适当比例混合，冰上裂解１ ｈ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ，离心３０ ｍｉｎ，取上清备用。
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　　第一向等电聚焦电泳（ＩＥＦ）使用ＩＰＧｐｈｏｒⅡ等电聚焦仪，参照仪器使用说明书进行操作，使用１８ ｃｍ，ｐＨ值３～１０的ＩＰＧ干胶条，３００ μｇ上样量；第二向ＳＤＳ－ＰＡＧＥ使用１２％的分离胶，电泳后的凝胶，参考Ｙａｎ等［９］的方法进行银染。双向电泳图谱利用Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司的Ｉｍａｇｅ ＭａｓｔｅｒＴＭ２Ｄ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ５．０软件进行分析，按照说明书操作。
　　１．４质谱鉴定
　　委托上海中科新生命生物技术有限公司采用电喷雾串联质谱（ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ）进行蛋白质检测分析。
　　２结果与分析
　　２．１幼虫4、5龄期黄血、白血蚕的血液蛋白含量变化
　　为了解Ｙ９２品种4、5龄期黄血、白血幼虫体血液蛋白含量的变化情况，从４龄第一天开始，测定各天血液蛋白质含量，结果见图１。
　　 从图１可知，Ｙ９２幼虫4、5龄期血液蛋白质含量随生长发育逐渐增多，５龄第八天到达最高值，黄血蚕９４．３６ μｇ／μＬ，白血蚕５４．８２ μｇ／μＬ。黄、白血幼虫体中的血液蛋白质含量在５龄第五天后逐渐变大，第八天达到最大，黄血蚕血液蛋白质含量高出白血蚕３９．５４ μｇ／μＬ。
　　２．２双向电泳分析
　　家蚕Ｙ９２幼虫５龄第六天黄血蚕（雌）、白血蚕（雄）的血液蛋白样品经双向电泳分析和银染法染色，其图谱如图２所示。
　　经ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒＴＭ２Ｄ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ５．０软件分析，在图２的黄血蚕、白血蚕５龄幼虫的血液蛋白中共检测到５０７个蛋白点，其中黄血蚕蛋白点２８７个，白血蚕蛋白点２２０个，相互能匹配的蛋白点有２０５对，匹配率为８０．９％；特异性蛋白点黄血蚕有８２个，白血蚕有１５个，其等电点和分子量列于表１、表２。
　　从表１和表２的结果看，黄血蚕特异性蛋白，分子量在１０～２９．９ｋＤ的占了总数的１３．４１％；３０～４９．９ｋＤ的占了总数的２３．１７％；７０～８９．９ｋＤ的占了总数的３９．０２％；９０ｋＤ以上的占了总数的１９．５１％。白血蚕的１５个特异性蛋白点，分子量的大小在１０～９９ｋＤ。在特异蛋白中，黄血蚕和白血蚕蛋白的等电点绝大多数分布在４.0～９．５。
　　对黄血、白血相配匹配的２０５对蛋白，经比对分析，黄血蚕血液蛋白含量为白血蚕３倍及以上的匹配蛋白点有４８对（表３），差异３.0～４．９倍的有２６个；５.0～６．９倍的有９个；７.0～８．９倍的有３个；９.0倍以上的有１１个。而白血蚕血液蛋白含量大于黄血蚕３倍以上的匹配蛋白点却只有１８对（表４），差异３.0～４．９倍的有１１个；５.0～６．９倍的有２个；７.0～８．９倍的有２个；９倍以上的有２个。
　　２．３黄血特异蛋白点的ＥＳＩ～ＭＳ～ＭＳ鉴定分析
　　通过从分析黄血蚕与白血蚕的双向电泳图谱（图２），我们发现黄血特异蛋白点中的２５４０号是一个白血蚕没有的、且容易提取的特异蛋白，于是将该蛋白提取送上海中科新生命生物技术有限公司用电喷雾串联质谱（ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ）进行质谱分析，图谱如图３所示。
　　质谱分析得到５段肽段序列，分别为：
　　ＶＦＧＴＬＧＱＮＤＤＧＬＦＧＫ
　　ＥＩＦＮＤＤＲＧＫＬＴＧＱＡＹＧＴＲＶＬＧＰＡＧＤＳＴＮＹＧＧＲ
　　ＮＡＥＡＡＩＤＩＮＲ
　　ＳＧＭＴＡＴＧＳＧＶＷＤＬＤＫＮＴＲＬＳＡＧＧＭＶＳＫ
　　ＲＰＤＶＧＶＱＡＥＦＲ
　　对以上序列，经与Ｉｎｓｅｃｔａ和Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ蛋白数据库的相关蛋白进行比对，与ｇｌｏｖｅｒｉｎ～ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４［Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ，在ＮＣＢＩ数据库中的登录号为５２４２１２１］有９５个氨基酸相匹配，匹配率为５５．５６％。
　　３讨论
　　家蚕茧色素物质的形成，是幼虫期蚕体从摄取的桑叶物质中转化而成，因而，蚕结黄茧还是白茧，茧色的表现如何，除了遗传基因起决定作用外，桑叶中的叶黄素、黄酮类化合物等色素物质能否被消化吸收，透过肠膜进入血腔再进入绢丝腺中，透过性便是一道屏障［１０］。根据我们对Ｙ９２血液的颜色观察，从３龄幼虫期的脚色便可观察出雌雄血液的颜色差异（雌黄血、雄白血），表明叶黄素、黄酮类化合物等色素物质已经在蚕体的血腔中形成，由此推测，色素物质在３龄前已经合成或桑叶中的色素物质经蚕体消化吸收进入到了血腔中。
　　从血液总蛋白含量的测定结果看，大蚕期的幼虫由于食桑量多，代谢旺盛，能大量将桑叶中的营养物质通过消化吸收，透过中肠肠壁进入血腔后合成蛋白质，使体内血淋巴的蛋白质含量逐渐积累性增多，到成熟前的第二天（５龄经过第八天），血液中的蛋白质含量最高，黄血蚕９４．３６ μｇ／μＬ，白血蚕５４．８２ μｇ／μＬ。黄血蚕与白血蚕的血液蛋白含量出现了较大的差别，此原因可能是黄血蚕（雌）的性腺旺盛发育，代谢比白血蚕（雄）大而产生的。家蚕在眠期，由于不食桑叶，而体内却进行着蜕皮的生理代谢，仍需大量消耗能量，此时血淋巴中的一部分蛋白质就会被转化为能量物质而消耗掉，故４龄期蚕和５龄期蚕时的血液蛋白含量均相对较低。
　　蚕体吐彩色茧丝的生理生化机制，目前国内外的研究报道不多，主要的报道有胡萝卜素、叶黄素从血淋巴到中部丝腺的的转运过程中，可能通过色素结合蛋白而实现在蚕体内的转运代谢的［１－３］。Ｊｉｎ等［１１］用双向电泳和计算机辅助分析方法发现一些蛋白高丰度地表达在家蚕黄茧限性品种的中部丝腺中，推测这些蛋白可能与家蚕茧色形成相关，本文利用双向电泳的图谱，比较分析了Ｙ９２黄血蚕与白血蚕蛋白的差异，特异蛋白方面，雌（黄血蚕）比雄（白血蚕）多，黄血蚕有８２个，白血蚕有１５个。相互匹配的蛋白点有２０５对，占能检测到的８０．９％；但其量值仍有较大的差别，黄血蚕有较多高丰度蛋白的表达，黄血蚕大于白血蚕３～４倍的蛋白点有２６个，９倍以上的有１１个。白血蚕大于黄血蚕３～４倍的蛋白斑点只有１１个，９倍以上的有２个。这一现象是否暗示了同一类别的蛋白，在不同血色或雌雄间可能表达着不同的活性与功能。至于两者之间存在着怎样的相互作用机制，以及这些蛋白在茧色素物质的代谢中起着怎样的作用，今后还需要更多的研究来揭示。
　　本试验虽然研究了家蚕茧色限性品种Ｙ９２幼虫4、5龄期血液蛋白的代谢变化规律，运用蛋白质组学的技术探讨了血液蛋白组分的差异表达，然而家蚕的茧色调控机制却非常复杂，有关色素在蚕体内的合成与转运机制仍有待我们今后继续研究。
　　
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　　［１１］ ＪＩＮ Ｙ Ｘ，ＸＵ Ｍ Ｋ，ＪＩＡＮＧ Ｙ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｆｅｍａｌｅ ａｎｄ Ｍａｌｅ＇ｓ Ｍｉｄｄｌｅ Ｓｉｌｋｇｌａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｃｏｃｏｏｎ Ｃｏｌｏｒ Ｓｅｘ－ｌｉｍｉｔｅｄ Ｓｉｌｋｗｏｒｍ Ｕｓｉｎｇ Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡｇｒｉｃｕＬｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１２（４）：４３１－４３５．
　　
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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