稻瘟病新抗性基因Pita2候选基因的表达载体构建 稻瘟病抗性分级

　　摘要：为了验证稻瘟病新抗性基因Ｐｉｔａ２的功能，利用长片段ＰＣＲ技术从基因的供体品种ＰｉＮｏ．４中扩增了２个候选基因Ｐｉｔａ２－１，Ｐｉｔａ２－２，长度分别为６．１ ｋｂ和１６．５ ｋｂ，电泳回收目的片段，然后利用双酶切分别克隆到植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００。对阳性克隆通过菌落ＰＣＲ、酶切鉴定和测序分析，已成功地获得了２个候选基因的重组阳性克隆，为进一步研究Ｐｉｔａ２基因的功能奠定了基础。
　　关键词：稻瘟病；候选抗性基因；长片段ＰＣＲ技术；表达载体
　　中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）10－2133-03
　　
　　Construction of Expression Vector for Candidate Genes of New Rice Blast
　　Resistance Gene Pita2
　　
　　ＺＨＡＮＧ Ｊｉ－ｃｈｅｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｎｇ－ｍｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｔａｉ，ＬＩＵ Ｘｕｅ－ｑｕｎ，ＸＵ Ｘｉｎ，ＬＩＵ Ｘｉｎ－ｑｉｏｎｇ
　　（Ｋｅｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｅｔｈｎｉｃ Ａｆｆａｉｒｓ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｏｕｔｈ－Ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００７４）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｒｉｃｅ， ａｎｄ ａ ｓｅｒｉｏｕｓ ｔｈｒｅａｔ ｔｏ ｒｉｃｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｎｅｗ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ． Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ Ｐｉｔａ２－１ ａｎｄ Ｐｉｔａ２－２， ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ＰＣＲ（ＬＲ－ＰＣＲ） ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒ ＰｉＮｏ．４． Ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｐｉｔａ２－１（６．１ ｋｂ）ａｎｄ Ｐｉｔａ２－２（１６．５ ｋｂ） ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲ， ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ｔｈｕｓ ｌａｉｄ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ Ｐｉｔａ２．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ； ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ； ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ＰＣＲ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
　　
　　稻瘟病是最具毁灭性的水稻病害之一，严重威胁着水稻的生产。相对于化学防治法的高成本和高污染，培育和合理利用抗病品种，是控制这一病害最经济和环保的方式手段［１，２］。由于稻瘟病菌生理小种的遗传复杂性及易变性，抗病品种常常推广种植几年后就丧失抗性［３，４］。发掘和创造具有广谱抗性的新抗源和抗性基因，是抗稻瘟病育种的主要研究方向。稻瘟病广谱新抗性基因Ｐｉｔａ２被定位于水稻第１２条染色体着丝粒区域一个大的基因簇内［５］。而这一基因簇包含了１４个已知的稻瘟病抗性基因，包括Ｐｉ２０、Ｐｉｔａ、Ｐｉｔａ２、Ｐｉ４、Ｐｉ６、Ｐｉ１２、Ｐｉ１９、Ｐｉ２１、Ｐｉ２４、Ｐｉ３１、
　　Ｐｉ３２、Ｐｉ１５７、Ｐｉｔｑ－６和Ｐｉ３９［６］。尽管Ｐｉｔａ已被克隆，并与相应的无毒基因间互作已在分子水平上得到了阐述［７］，但由于着丝粒区域的高度重复序列和抑制重组的特性，导致这一区域的研究进展缓慢。
　　开展稻瘟病广谱抗性基因Ｐｉｔａ２的克隆及功能研究，对加快着丝粒相关区段基因资源的开发和有效利用，以及新的抗性品种育成具有重要的应用价值，同时也对探讨抗性基因的起源及其进化的分子机理具有一定的参考价值。
　　１材料与方法
　　 水稻品种为携带Ｐｉｔａ２的抗病品种ＰｉＮｏ．４，大肠杆菌菌株ＤＨ１０Ｂ，双元载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００，均由中南民族大学生物技术国家民委重点实验室提供。ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶长片段ＰＣＲ扩增试剂盒（ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，２×ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ，ｄＮＴＰ），Ｔ４ ＤＮＡ连接酶，碱性磷酸酶（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ。ＣＩＡＰ），购自ＴａＫａＲａ公司；ＡｘｙＰｒｅｐ质粒提取试剂盒、ＤＮＡ凝胶回收试剂盒，以及ＰＣＲ清洁试剂盒，购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；ＰＣＲ引物由金思瑞科技（南京）有限公司合成。
　　水稻基因组ＤＮＡ利用ＣＴＡＢ法提取。利用软件Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０对Ｐｉｔａ２的２个候选基因Ｐｉｔａ２－１和Ｐｉｔａ２－２设计特异性引物。利用长片段ＰＣＲ技术扩增目的片段，扩增片段包括基因的５′启动子和３′终止子区域，ＰＣＲ程序采用两步法：９４℃预变性２ ｍｉｎ，然后进行３０个循环：９４℃，３０ ｓ；６５℃，６．５ ｍｉｎ；７２℃，１０ ｍｉｎ，其中退火温度和延伸时间根据候选基因的大小和引物序列作相应的变化。用ＡｘｙＰｒｅｐ胶回收试剂盒分别回收和纯化目的片段后，将2个候选基因利用限制性内切酶ＫｐｎⅠ和ＨｉｎｄⅢ分别克隆到ｐＣＡＭＢＩＡ１３００载体上。然后对阳性克隆通过菌落ＰＣＲ和酶切鉴定，并且测序验证。
　　２结果与分析
　　２．１候选基因的扩增
　　以Ｐｉｔａ２候选基因的特异性引物对水稻品种ＰｉＮｏ．４的基因组ＤＮＡ进行长片段ＰＣＲ梯度扩增。候选基因Ｐｉｔａ２－１在退火温度为６４．１℃和６３．０℃时，都获得了１条６．１ ｋｂ的特异性好而强的单带（图１）；Ｐｉｔａ２－２在退火温度为６２．８℃和６２．０℃时，均获得了１条１６．５ ｋｂ的特异性较好的单带（图２）。
　　２．２候选基因的表达载体构建
　　对扩增的目的片段，分别回收、纯化，利用双酶切分别克隆到ｐＣＡＭＢＩＡ１３００载体，经蓝白斑筛选，菌落ＰＣＲ和酶切鉴定（图３，图４），分别获得２个候选基因的阳性重组子。对插入片段测序后，在ＧｅｎＢａｎｋ中通过ＢＬＡＳＴＮ进行核酸同源性搜索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。结果表明，插入片段的序列着陆到水稻测序品种日本晴的第１２条染色体上，该区域与目的基因的物理定位区域一致。
　　３讨论
　　在完成图位克隆中的抗性基因精细定位后获得图位克隆是最关键的步骤，最关键步骤是获得目的基因的候选基因克隆，但在常规的图位克隆技术体系中，通常通过构建大片段基因组人工染色体文库，然后利用与目的基因共分离的分子标记来筛选文库而获得其候选基因的克隆，该过程由于必须对该候选基因进行亚克隆，而且亚克隆技术存在耗时、花费高的缺点［7，8］，而且对筛选到的候选基因克隆必须亚克隆才能进行遗传转化。而亚克隆技术存在切断目的基因甚至遗漏目的基因等缺点［７，８］。通过长片段ＰＣＲ技术可以快速、高效地直接从基因组ＤＮＡ中扩增得到完整的目的基因［９，１０］，这将极大地缩短图位克隆的时间。该研究中利用长片段ＰＣＲ技术成功地获得了２个候选基因片段，并通过双酶切将其克隆到植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００，下一步将通过农杆菌介导的遗传转化转入感病品种。该研究为稻瘟病新抗性基因Ｐｉｔａ２的功能验证奠定了一定的基础。
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