什么是免疫细胞【香菇多糖对黄颡鱼免疫细胞活性的影响】

　　摘要：试验选取５４０尾黄颡鱼（Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ），对其连续投喂含不同水平香菇多糖（Ｌｅｎｔｉｎａｎ，ＬＮＴ）的配合饲料８周。采用Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心等技术，对黄颡鱼头肾巨噬细胞与外周血白细胞进行分离纯化，使用ＮＢＴ还原法、Ｇｒｉｅｓｓｅ试剂显色法与ＭＴＴ法测定头肾巨噬细胞呼吸爆发活性与外周血白细胞的增殖能力，以探讨香菇多糖对黄颡鱼免疫细胞活性的影响。结果表明香菇多糖各水平组均能提高黄颡鱼头肾巨噬细胞的氧呼吸爆发活性，且１ ２００～１ ５００ ｍｇ／ｋｇ水平组提高作用极显著（Ｐ＜０．０１）；香菇多糖各水平组能提高黄颡鱼头肾巨噬细胞氮呼吸爆发活性，其中６００ ｍｇ／ｋｇ水平组活性显著提高（Ｐ＜０．０５），９００～１ ５００ ｍｇ／ｋｇ水平组活性提高效果极显著（Ｐ＜０．０１）；投喂香菇多糖还能显著提高黄颡鱼外周血白细胞的增殖能力（Ｐ＜０．０５），且６００～１ ５００ ｍｇ／ｋｇ水平组促进作用极显著（Ｐ＜０．０１）。可见，香菇多糖可以有效地提高黄颡鱼免疫细胞的活性。
　　关键词：黄颡鱼；香菇多糖；免疫细胞活性；呼吸爆发；细胞增殖
　　中图分类号： Ｒ９７９．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1855-04
　　
　　Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｎａｎ ｏｎ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｙｅｌｌｏｗ Ｃａｔｆｉｓｈ （Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ）
　　
　　ＢＡＩ Ｄｏｎｇ－ｑｉｎｇ，ＷＵ Ｘｕａｎ，ＺＨＵ Ｇｕｏ－ｘｉａ，ＮＩＮＧ Ｂｏ
　　（Ｔｉａｎｊｉｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ＡＱＵ－Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｔｅａｃｈｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００３８４， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： ５４０ ｙｅｌｌｏｗ ｃａｔｆｉｓｈ（Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ） ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｆｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｎａｎ ｆｏｒ ８ ｗｅｅｋｓ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｋｉｄｎｅｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｙｅｌｌｏｗ ｃａｔｆｉｓｈ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ Ｐｅｒｃｏｌl ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ＮＢＴ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ， Ｇｒｉｅｓｓe ｒｅａｇｅｎｔ colorimetry ａｎｄ ＭＴＴ ａｓｓａｙ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｕｒｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｅａｄ ｋｉｄｎｅｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｉｓｃｕｓｓ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＬＮＴ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｙｅｌｌｏｗ ｃａｔｆｉｓｈ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｏｘｙｇｅｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｕｒｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｅａｄ ｋｉｄｎｅｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＬＮＴ； ａｎｄ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ between １ ２００ ｍｇ／ｋｇ ａｎｄ １ ５００ ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．０１）． Ｔｈｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｕｒｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｌｌ ｔｈｅ ＬＮＴ ｇｒｏｕｐｓ ｗａｓ ａｌｓｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ， and 600 ｍｇ／ｋｇ LNT level increased significantly（Ｐ＜０．０5）， ａｎｄ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｔ ９００~１ ５００ ｍｇ／ｋｇ ＬＮＴ ｌｅｖｅｌ（Ｐ＜０．０１）． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ａｌｌ ｔｈｅ ＬＮＴ ｇｒｏｕｐｓ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ（Ｐ＜０．０5）； ａｎｄ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｒｏｍ ６００ ｍｇ／ｋｇ ｔｏ １ ５００ ｍｇ／ｋｇ（Ｐ＜０．０１）． Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ＬＮＴ ｃｏｕｌｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｙｅｌｌｏｗ ｃａｔｆｉｓｈ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｙｅｌｌｏｗ ｃａｔｆｉｓｈ（Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ）； Ｌｅｎｔｉｎａｎ（ＬＮＴ）； ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ； ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｕｒｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
　　随着人们对水产品质量要求的不断提高与治疗用抗生素长期使用导致养殖品种耐药性增强两者间矛盾的深化，寻求一种低毒、安全、高效的新型免疫增强剂替代药物，已经成为水产养殖领域中的重要任务。香菇多糖（Ｌｅｎｔｉｎａｎ，ＬＮＴ）是从香菇子实体中分离出的天然活性成分［１］，并因其具有良好的抗肿瘤、抗病毒、调节机体免疫力、刺激干扰素形成等功效逐渐引起了人们的关注。但目前，关于使用香菇多糖增强机体免疫力的研究还主要集中在临床与畜禽养殖中，在水产动物中使用甚少，而在黄颡鱼（Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ）中还未见报道。基于此，本研究选取优质经济鱼类――黄颡鱼作为研究对象，对其投喂含不同水平香菇多糖的配合饲料，通过检测其头肾巨噬细胞的呼吸爆发活性与外周血白细胞的增殖能力，寻求适宜的添加水平，并为日后黄颡鱼疾病防治及免疫增强剂的开发提供理论依据。
　　１材料和方法
　　１．１试验材料
　　１．１．１试验用鱼及养殖条件２龄健康黄颡鱼５４０尾取自天津农学院养殖渔场，平均体重（６１．８±２．０）ｇ，平均体长（１９．５±２．０）ｃｍ。试验鱼饲养于架设在养殖池中的１．５ ｍ×１．５ ｍ×１．０ ｍ的１８个网箱中，每箱随机投放黄颡鱼３０尾（雌雄各半）。香菇多糖以３００、６００、９００、１ ２００、１ ５００ ｍｇ／ｋｇ ５个水平添加于饲料中，每组３个平行，以不添加多糖的基础饲料（粗蛋白３８．１４％，粗灰分１２．３７％，粗脂肪３．０８％，水分１２．３６％）为对照。试验期间水温保持在（２６±２）℃，每天连续充氧，试验期间每天换水１／３左右。日投饵率为２％，每日投喂３次。
　　１．１．２多糖的制备试验用香菇多糖粗提物（纯度５０％）购于陕西方晟生物科技公司，粗多糖采用Ｓｅｖａｇｅ法［２］去除蛋白，并采用ＤＥＡＥ－纤维素柱层析和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２００凝胶柱进一步纯化香菇多糖［３］，最终采用苯酚－硫酸法［４］测定多糖的有效含量。香菇多糖经过逐步分离纯化后，最终的纯度大于９０％。
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　　１．２试验方法
　　１．２．１黄颡鱼头肾巨噬细胞与外周血白细胞的分离使用ＭＳ-２２２麻醉后，采用Ｂａｙｎｅ法［５］分离黄颡鱼头肾巨噬细胞。使用Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度法［６］分离头肾巨噬细胞，并使用台盼蓝进行细胞活性检测并计数，以确保活细胞的数量大于９０％，调整细胞浓度为１．０×１０７个／ｍＬ。２７ ℃培养备用。在无菌的条件下进行尾静脉抽血，外周血白细胞的分离方法同头肾巨噬细胞。
　　１．２．２免疫细胞活性指标检测头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活性的测定采用ＮＢＴ法［７］。每个多糖水平组细胞设８个平行，以添加ＬＰＳ（５００ μｇ／ｍＬ）的细胞液作为阳性对照，以检测细胞在培养过程中的活性。使用Ｔｈｅｒｍ ３００１型酶联免疫检测仪，在６２０ ｎｍ下，测定吸光值。头肾巨噬细胞氮呼吸爆发活性的测定采用Ｇｒｉｅｓｓ试剂法［８］，其他操作同氧呼吸爆发活性测定。在５４０ ｎｍ下测定吸光值。外周血白细胞的增殖采用ＭＴＴ法［９］检测，每个多糖水平组细胞设１２个平行，以添加ＬＰＳ（５００ μｇ／ｍＬ）的细胞液作为阳性对照，培养２４ ｈ后，在５７０ ｎｍ下测定各孔光吸收值，记录结果。每个指标检测中每个水平均检测６尾鱼。
　　１．２．３数据处理试验数据用平均值±标准误表示，数据分析采用ＳＰＳＳ１７．０软件包中的单因素方差分析（ｏｎｅ－ｗａｙ－ＡＮＯＶＡ）。
　　２结果与分析
　　２．１香菇多糖对黄颡鱼头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活性的影响
　　连续投喂黄颡鱼含不同水平香菇多糖的饲料８周后，检测其头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活性发现：较高浓度的ＬＰＳ（阳性对照）能显著提高头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活性（Ｐ＜０．０１），这说明试验中培养的细胞状态良好；与空白对照组相比，各水平香菇多糖均能提高黄颡鱼头肾巨噬细胞的氧呼吸爆发活性，在１ ２００～１ ５００ ｍｇ／ｋｇ水平时提高作用极显著（Ｐ＜０．０１）；其中１ ２００ ｍｇ／ｋｇ和１ ５００ ｍｇ／ｋｇ组间差异不大（Ｐ＞０．０５）（图１，表１）。从提高黄颡鱼头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活性的角度考虑，饲料中香菇多糖的适宜添加量为１ ２００ ｍｇ／ｋｇ。
　　２．２香菇多糖对黄颡鱼头肾巨噬细胞氮呼吸爆发活性的影响
　　用不同水平的香菇多糖饲料投喂黄颡鱼８周后，测定各组黄颡鱼头肾巨噬细胞氮呼吸爆发活性。与图１相似，阳性对照组（ＬＰＳ组）巨噬细胞氮呼吸爆发活性明显提高（Ｐ＜０．０１）；黄颡鱼头肾巨噬细胞氮呼吸爆发活性随香菇多糖水平的增加而提高。与空白对照相比，除３００ ｍｇ／ｋｇ多糖组氮呼吸爆发活性提高不明显外，其余各组氮呼吸爆发活力依次分别提高２３．９４％（Ｐ＜０．０５），３４．２９％、５７．８％、７１．５％（Ｐ＜０．０１），且1200 ｍｇ／ｋｇ和1500 ｍｇ／ｋｇ水平组间活性变化不大（Ｐ＞０．０５）（图2，表１）。从头肾巨噬细胞氮呼吸爆发活性提高角度分析，选择１ ２００ ｍｇ／ｋｇ香菇多糖水平添加到饲料中较适宜。
　　２．３香菇多糖对黄颡鱼外周血白细胞增殖的影响
　　用含有不同水平的香菇多糖饲料投喂黄颡鱼８周后，黄颡鱼外周血白细胞增殖活性明显提高，阳性对照组（ＬＰＳ作用组）外周血白细胞增殖明显提高；与空白对照组相比，各多糖水平组黄颡鱼外周血白细胞增殖能力依次分别提高１．４（Ｐ＜０．０５）、２．３、２．６、３．４与４．０倍（Ｐ＜０．０１），且１ ５００ ｍｇ／ｋｇ水平组的增殖能力高于阳性对照组（Ｐ＜０．０１），（见图３，表１）。可见，从提高黄颡鱼外周血白细胞增殖角度考虑，饲料中添加香菇多糖适宜水平为１ ２００～１ ５００ ｍｇ／ｋｇ。
　　３讨论
　　３．１香菇多糖提高免疫细胞活性的作用机理
　　香菇多糖具有能抵抗多种细菌、病毒和寄生虫入侵的免疫学活性，这种免疫作用并非直接攻击病原体，而是通过激活免疫细胞，促使其成熟、分化和增殖，改善机体平衡，从而达到增强机体自身免疫作用的目的［１０］。其提高免疫细胞活性作用机理可以概括为以下两点：①香菇多糖具有活化巨噬细胞的作用，而活化后的巨噬细胞可分泌活性氧、一氧化氮、白介素等与免疫应答及炎症有关的生物活性物质。②香菇多糖是一种胸腺依赖型Ｔ细胞导向并有巨噬细胞参与的特殊免疫佐剂［１１］，可以促进淋巴细胞活化因子（ＬＡＥ）产生，刺激或恢复辅助性Ｔ细胞活性功能，提高淋巴细胞转化率，促进抗体形成，也可被称为免疫复原物质。
　　３．２香菇多糖对动物免疫细胞活性的影响
　　国内外学者在香菇多糖提高陆上动物机体免疫细胞活性方面已进行了一定的研究，但在水产动物上的研究相对较少，尤其是在黄颡鱼中的使用尚未见报道。体外培养时，香菇多糖能明显促进鲤鱼头肾巨噬细胞的氧呼吸爆发活性，且１００ μｇ／ｍＬ浓度组效果最佳；能极显著地提高鲤鱼外周血白细胞的增殖能力；但对氮呼吸爆发活性影响不大，且存在高浓度抑制现象［１２］。香菇多糖协同ＣｏｎＡ或ＬＰＳ能显著促进小鼠脾淋巴细胞的增殖［１３］；还可诱导小鼠腹腔巨噬细胞ＮＯ生成量增加，并可增高ｉＮＯＳ活性，且呈明显的剂量依赖关系［１４，１５］。体内注射香菇多糖能明显提高荷瘤小鼠外周血白细胞的总数，尤以淋巴细胞数增加最为显著［１６］。投喂香菇多糖可提高鸡血液中淋巴细胞的转化水平［１７］；静脉注射香菇多糖还可以增加小鼠与家兔因放、化疗而减少的白细胞数量［１８］。本试验中口服香菇多糖能促进黄颡鱼头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活性和外周血白细胞的增殖能力，这与上述研究结果相互印证，而本试验中头肾巨噬细胞氮呼吸爆发活性与香菇多糖量存在明显的剂量依赖关系，高浓度组作用极显著，这与曹丽萍等［１２］研究结果不符，究其原因可能是与鱼的种类、香菇多糖添加方式或添加剂量不同有关。
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