猴头菌活性多糖高产菌株的筛选_猴头菌多糖

　　对10株猴头菌（Hericium erinaceus）菌株的菌丝多糖产量和体外免疫活性进行比较。结果表明：不同的猴头菌菌株发酵所产生的菌丝多糖量及其多糖对刺激巨噬细胞产生NO的产量不同；其中华中猴头（H10）不仅菌丝多糖量高且对巨噬细胞的刺激作用也较强，可作为深层发酵生产猴头菌菌丝多糖的优良菌株。
　　猴头菌菌株； ITS序列； 菌丝多糖； 巨噬细胞； NO
　　猴头菌(Hericium erinaceus)是我国著名的食药两用菌。自古就有“山珍猴头”之说［1］，其药用成分猴头菌多糖可从子实体和发酵菌丝体中提取得到，具有保肝护胃、降血糖、保护神经、增强人体免疫力、抗癌、抗氧化等功效［2-4］。深层发酵周期短、可控性好，已广泛用于猴头菌多糖的生产，研究表明，不同菌株产生多糖的组分和结构有显著差异［5,6］，因此，菌株的选用成为深层发酵生产猴头菌多糖产量和质量的关键。笔者对收集到的10个猴头菌菌株液体培养后的菌丝多糖量、菌丝多糖体外免疫活性进行比较，以筛选出多糖量和活性较高的菌株。
　　1 材料与方法
　　1.1供试菌株及来源
　　供试菌株0627、0608、0617、0611、0605分别编号为H1-H5，由上海市农业科学院食用菌研究所提供；长刺猴头、911、920、猴头王、华中猴头分别编号为H6-H10，其中长刺猴头和华中猴头由华中食用菌栽培研究所提供，911和920由江苏高邮食用菌研究所提供，猴头王由牡丹江海丰食用菌研究所提供。
　　1.2菌丝体的培养
　　供试菌株于PDA平板上活化后，取直径为0.6 cm的菌块，接种至装有100 mL液体摇瓶培养基（4%葡萄糖、1%酵母膏、0.1% KH2PO4、 0.05% MgSO 4?7H 2O）的250 mL三角瓶中， 26 ℃，150 r/min培养12 d，用无菌匀浆机将菌丝球捣碎，然后用灭菌的移液管取10 mL接种至装有100 mL二级摇瓶培养基（培养基成分同上）的250 mL三角瓶中，26 ℃，150 r/min培养7 d，发酵液用滤布过滤后，收集菌丝体，用蒸馏水冲洗3～4次，冷冻干燥后称重，每个菌株收集6瓶，实验重复3次。
　　1.3菌丝多糖量的测定
　　将1.2中冻干的菌丝球磨碎后取粉末样品 2 g，加 90 mL蒸馏水，沸水浴提取2 h，提取液加蒸馏水定容至100 mL，量取10 mL，加无水乙醇150 mL，摇匀，4 ℃放置12 h，4000 g离心 20 min，沉淀用10 mL 95%的乙醇洗涤2次，4000 g离心20 min。用蒸馏水将沉淀定容至 50 mL，用苯酚-硫酸法测定总糖含量［7］。
　　菌丝多糖含量=总糖含量×0.9
　　菌丝多糖总量=发酵菌丝生物量×菌丝多糖含量
　　1.4菌丝粗多糖的制备
　　取菌丝体粉末样品3 g，加入54 mL蒸馏水，沸水浴提取2 h，过滤，滤渣重复提取1次，合并提取液，在旋转蒸发仪上减压浓缩至10 mL，15000 g离心30 min，取上清加入乙醇至终浓度70%，摇匀，4 ℃放置12 h，4000 g离心20 min，沉淀用同样浓度的乙醇洗涤2次。粗多糖样品用截留分子量为3500 Da的透析袋对水4 ℃透析3 d，冻干，分别命名为HEP1～HEP10。
　　1.5菌丝粗多糖对RAW264.7细胞释放NO产量的影响
　　用PBS （含0.14 mol/L NaCl, 0.027 mol/L KCl, 0.004 mol/L Na 2HPO 4, 0.002 mol/L KH 2PO 4, pH 7.4）分别将HEP1～HEP10配成0.5、2、5 mg/mL 的溶液（作用终浓度分别为50、200、500 mg/mL），按文献［8］的方法测定各多糖样品对巨噬细胞释放NO产量的影响。
　　2 结果与分析
　　2.1菌丝多糖产量
　　十个猴头菌菌株中，H2（0608菌株）菌丝多糖含量最高，但是发酵所得生物量低；H10（华中猴头）菌丝生物量最高，其次为H9和H6，多糖总量最高的是H9,其次为H10、H8，最低的 是H3（表1）。
　　李巧珍，等：猴头菌活性多糖高产菌株的筛选
　　2.2菌丝粗多糖对RAW264.7释放NO产量的影响
　　各菌株的菌丝粗多糖刺激RAW264.7细胞释放NO的产量有差异（图1）。RAW264.7产生NO的量随着样品浓度的增大而上升，具有浓度依赖性。在低浓度50 μg/mL时，HEP3和HEP7对RAW264.7 释放NO的量无影响，HEP1和HEP10对RAW264.7 的刺激作用最强。
　　** 与PBS比在0.01水平上有显著差异
　　** Significant difference (P < 0.01) compared with PBS
　　3 讨论
　　刘颖［5］和丁剑［6］对猴头菌的两个不同菌种在相同条件下发酵、提取、分离及纯化的胞外多糖进行研究，发现其多糖在分子量、单糖组成和结构上存在明显差异。吴迪等［11］ 的研究表明，不同产地的猴头菌子实体提取的多糖含量及其单糖组成和相同分子量多糖所占的比例均存在显著性差异。本实验结果表明，不同菌株发酵产生的菌丝粗多糖量和体外免疫活性上都有差别,在本实验条件下，华中猴头（H10）菌株不仅菌丝粗多糖产量高而且其菌丝粗多糖体外免疫活性也高，可以考虑作为深层发酵生产猴头活性菌丝粗多糖的菌种。对于活性高但菌丝多糖量低的菌株0627（H1），可考虑优化其发酵条件，以提高多糖产量。因此，在猴头菌的深度开发利用时，需针对目标活性成分对其菌株进行优选，以获得更适于开发利用的优良品种。
　　董宜勋.中国食用蘑菇大观［M］.北京：中国旅游出版社，1986.
　　［2］ 樊伟伟, 黄惠华. 猴头菇多糖研究进展［J］. 食用菌, 2008, 29(1): 355-358.
　　［3］ WANG JC. Antitumor and immunoenhancing activities of polysaccharide from culture broth of Hericium spp.［J］. Medical Sciences, 2001, 17(9):4612-4671.