硫磺菌 野生硫磺菌分离株ITS序列分析
采用组织分离的方法从野生硫磺菌(Laetiporus sulphureus)子实体上分离得到菌株ts，以其基因组为模板扩增获得该菌株的ITS序列，序列分析结果表明：该菌株与GenBank中 Laetiporus sulphureus var. sulphureus的3个日本分离株聚为一簇，ITS核苷酸一致率为98.31%～99.25%，而与其它22个来自不同国家的硫磺菌属菌株的ITS核苷酸一致率为91.93%～98.12%，依此结果，ts菌株应为 L. sulphureus var. sulphureus。
硫磺菌硫磺原变种； 转录间隔区
硫磺菌（Laetiporus sulphureus）又名硫磺多孔菌、硫色多孔菌，为担子菌门（Basidiomycota）、伞菌亚纲 （Agaricomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、白肉迷孔菌科（Fomitopsidaceae）、硫磺菌属（Laetiporus）真菌［1］，是一种食药兼用大型真菌。该菌子实体单生或覆瓦状生于柳树（ Salix sp.）、板栗（Castanea sp.）等阔叶树干或树枝上。子实体肥厚，幼时可食用，味道较好；也可药用，性温，味甘，能调节肌体，增进健康、抵抗疾病，是治疗乳腺癌、前列腺癌的辅助药物［2-4］。
硫磺菌的形态特征已有记载［5］。目前还未见有对其进行ITS序列分析的报道。笔者从泰山上采集到一株野生硫磺菌子实体，通过组织分离方法，3次纯化后获得其纯培养，利用现代生物技术手段获得了该菌株的ITS序列并构建了系统发育树，初步明确了其分类地位，以期为育种工作提供遗传背景清楚的野生种质资源，同时为驯化栽培提供参考。
1 材料与方法
1.1培养基
PDA加富培养基：200 g去皮马铃薯，40 g麸皮，20 g葡萄糖，3 g磷酸二氢钾，1.5 g硫酸镁，20 g琼脂，水定容至1 L，pH自然。
1.2菌株来源
野生硫磺菌（L. sulphureus）子实体采自泰山药乡林场（海拔700～ 800 m）20多年生栎树（Quercus sp.）树干上。
参照文献 ［6］方法进行组织分离、纯化和培养，获得菌株，标号为ts。
1.3菌落及菌丝形态观察
将保存的ts菌株切取5 mm2的小块，接种于PDA加富平板培养基中央，25 ℃黑暗培养，观察菌落形态。挑取少量菌丝体，置于载玻片上，适度按压到菌丝分散后进行显微观察。
1.4菌丝体制备及DNA的提取
将在PDA加富斜面培养基上保存的菌丝纯培养切取5 mm2的小块，接种于PDA加富平板培养基中央， 25 ℃黑暗培养5～7 d，待菌丝接近生长到平板边缘，刮取菌落边缘的新鲜菌丝用于基因组DNA的提取。采用改良的CTAB法提取总DNA［7］。
1.5ITS扩增
参照文献［8］所报道的用于真菌ITS区域扩增的通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增。PCR反应体系（25 μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL，正向和反向引物各1 μL（0.4 nmol/L），Taq DNA聚合酶0.3 μL（ 1 U），模板DNA 0.5 μL（20 ng），ddH2O 18.7 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。所用试剂均为大连宝生物公司产品。
1.6PCR产物的克隆与测序
按照试剂盒（博大泰克生物基因技术有限公司，北京）说明书回收PCR产物后与pMD18-T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（全式金生物技术有限公司，北京），提取质粒，经PCR扩增和酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海博亚有限公司测序。
1.7构建系统发育树
将所得DNA序列输入GenBank进行Blast检索，采用Clustalx1.81、DNASTAR、DNAMAN和MEGA 4软件对所得到的核苷酸序列与GenBank中收录相近菌株的相应序列进行比较和分析，并构建系统进化树。
2 结果与分析
2.1菌株ts菌落形态及显微观察
在PDA加富培养基上，菌株ts菌丝初期为浅黄色，呈同心圆形（图1A）；后期布满整个平皿（图 1B）。培养条件下，菌丝光滑无色、多弯曲、多分支、有隔及具明显的锁状联合；分生孢子梗组成了大部分的菌丝体，分生孢子梗在每个分支的终端可生成1个宽卵形至亚球形的分生孢子，分子孢子壁薄、里面富含原生质（图2A）；培养过程中还可以产生很多的厚垣孢子，厚垣孢子长椭圆形、壁厚、略大于分生孢子（图2B）。
兰玉菲，等：野生硫磺菌分离株ITS序列分析
2.3序列测定与分析
克隆测序结果表明扩增产物长度为618 bp（GenBank登录号为JF946748），其中包括 30 bp 18S rDNA基因序列、165 bp 内转录间隔区1（ITS1）、158 bp 5.8S编码序列、209 bp 内转录间隔区2（ITS2）和56 bp的28S rDNA。进行 同源性比对并构建系统进化树（图4），结果菌 株ts与GenBank中Laetiporus sulphureus var. sulphureus的3个日本分离株（L51，AB308145；WD820，AB308135；L50-5，AB308150）聚为一簇，ITS核苷酸一致率为98.31%～99.25%，而与其它22个来自不同国家的硫磺菌属菌株的ITS核苷酸一致率为91.93%～98.12%，依此结果将ts菌株鉴定为L. sulphureus var. sulphureus。
0.005碱基差异; 分支上的数字是1000次自展的数据支持率
Scale bar represents a 0.5% estimated difference in nucleotide sequence; Numbers above the branches are bootstrap values (%) of 1000 replicates