鸡传染性法氏囊病病毒福建株的分离与初步鉴定_传染性法氏囊病毒

　　摘要从临床表现胸腿肌出血、法氏囊肿大出血为主要特征的病死鸡肝脾和法氏囊中分离到1株病毒(IBDV-FJ)。结果表明,该分离病毒无血凝性,在琼脂扩散试验中能与抗IBDV特异性血清出现1条清晰的白色沉淀线;人工感染28日龄雏鸡出现与临床一致的病变,并回收到病毒;应用针对IBDV VP3基因的特异性引物进行RT-PCR,能扩增到长度为1 041bp的特异性目的片段;序列分析发现分离毒VP3基因与IBDV超强毒和经典毒株的核苷酸同源性分别为97.7%～98.2%和95.2%。初步鉴定该分离毒为鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株。
　　关键词鸡传染性法氏囊病病毒;超强毒株;分离;鉴定
　　中图分类号S851.34+7.2文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)11-0218-02
　　
　　传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是1种危害幼龄鸡的急性、高度接触性免疫抑制性传染病,3～6周龄雏鸡最易感,7日龄内雏鸡感染可引起严重的免疫抑制,导致感染鸡对其他疫苗的免疫失败。1979年在我国北京郊区发现该病[1];1980年周蛟等从北京进口的鸡群中分离到IBD-CJ801株[2],随后全国各地陆续有该病发生和流行的报道;1985年,在美国Delmarve家禽生产地区发现了1个变异株,它能逃脱标准疫苗株母源抗体的保护;1989年,Ch- ettle等在荷兰分离出高致病力的IBDV毒株(very virulent inf ectious bursal disease virus,vvIBDV);近年来国内也报道了vvIBDV的流行[3-6]。
　　2007年福建省某鸡场35日龄2 000多羽免疫鸡群突然发病死亡,发病率和死亡率分别达73%和52%,剖检变化主要为胸肌和腿肌条状出血;法氏囊明显肿大为正常法氏囊的2~4倍,有的外观呈紫葡萄状,切开后可见内侧皱褶面出血,有的可见干酪样物质或炎性分泌物,肾肿胀、尿酸盐沉积,脾脏肿大,表面斑驳。经免疫荧光试验检测,初步诊断为鸡传染性法氏囊病。故无菌采集病鸡法氏囊、肝脾等组织进行病毒分离与鉴定,现将结果报告如下。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1试验动物和血清
　　9～10日龄SPF鸡胚购自福建省生药厂;28日龄雏鸡为非免疫健康鸡并经AGP检测母源抗体阴性;抗IBDV阳性血清购自中监所;抗IBDV单抗由福建省农科院畜牧兽医研究所动物病毒研究室提供。
　　
　　1.2受体菌、质粒载体和主要试剂
　　E.coil JM109菌株由福建省农科院畜牧兽医研究所动物病毒研究室提供;T4DNA连接酶、pMD18-T载体、鼠源反转录酶(M-MLV)、RNA酶抑制剂(RNasin)、rTaq聚合酶、Trizol试剂盒购自宝生物工程有限公司(大连);DNA胶回收试剂盒与质粒快速提取试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司。
　　
　　1.3病毒分离
　　1.3.1病料采集与处理。无菌采集具典型病变的病死鸡法氏囊及肝脾,加Hank’s制成20%匀浆,冻融3次,4 000rpm离心15min,取上清液加青霉素、链霉素各1 000IU/mL,置4℃冰箱中过夜处理备用。
　　1.3.2鸡胚接种。取上清液,经绒毛尿囊膜接种9～10日龄SPF鸡胚,每胚0.2mL。收集48～120h的死胚尿囊液和胚膜混合匀浆,离心取上清液即为分离毒记IBDV-FJ。
　　
　　1.4病毒鉴定
　　1.4.1人工感染试验。分离毒经点眼、滴鼻接种28日龄雏鸡4只,每只0.2mL,同时以健康雏鸡为对照,隔离饲养。观察发病死亡情况,并收集病死鸡法氏囊,用于制备AGP抗原和回收病毒。
　　1.4.2AGP抗原制备。采集人工感染病死鸡法氏囊,用生理盐水作1∶4匀浆处理,置冰箱中冻融3次,离心,取上清液即为分离毒AGP抗原。
　　1.4.3琼脂扩散试验。制备厚3mm 1%琼脂(含8%NaCl)平板,按常规打孔,中央孔加标准抗IBDV阳性血清,周围孔加分离毒AGP抗原,置湿盒中37℃过夜,观察结果。
　　1.4.4免疫荧光试验。取临床采集或人工感染病死鸡法氏囊制成6μm厚的冰冻切片,用冷丙酮固定10min,加抗IBDV单抗,置湿盒中37℃ 30min,再加FITC标记的羊抗鼠-IgG 30min,洗涤后以甘油-PBS封片。荧光显微镜下观察,以出现亮绿色荧光病灶判定为阳性。
　　1.4.5分离毒VP3基因RT-PCR鉴定。①引物的设计与合成。根据GenBank上已公布的vvIBDV VP3基因序列,用OLIGO 6.0软件设计1对引物:Pl:5′-CAGCTTGCATGC CTGCAGG-3′;P2:5′-AACCTGATTACGAATTCGAGCT CG-3′,两引物位于IBDV VP3基因首末端保守区,扩增产物约为1 041bp,由宝生物工程有限公司(大连)合成。②RNA提取。取250μL病毒液加入750μL Trizol RNA提取液,混匀,室温放置15min。加入200μL氯仿,振荡混匀,4℃ 12 000 rpm离心15min。取上清加入500μL异丙醇,室温放置10 min,12 000rpm离心10min。弃上清,75%乙醇除盐,倒置滤纸上吸掉剩余液体,干燥后悬于25μL的DEPC水中,备用。③cDNA合成。取8μL病毒RNA,加入上下游引物P1\P2各1μL,100℃热吸附10min,立即置于冰上10min,继续加入5×first Standing Buffer 4μL、2.5Mm dNTPs 2μL、0.1mM DTT 2μL、M-MLV 1μL、Rnasin 1μL,37℃温育2h,取出后置4℃保存备用。④PCR扩增。取制备好的cDNA 4μL作模板,加入上下游引物P1\P2各1μL、2.5mM dNTPs 8μL、10×buffer 10μL、rTaq 1μL、灭菌水75μL,反应体系为100μL。在PCR扩增仪内进行扩增,扩增条件为:95℃预变性5min,94℃变性1min、52℃复性1min、72℃延伸2min,35个循环,72℃ 10min。结束后取PCR产物4μL,在1%琼脂凝胶上电泳。
　　1.4.6扩增产物序列测定。应用胶回收试剂盒回收PCR产物,与pMD18-T载体连接后转化E.coil JM109,筛选并经PCR鉴定阳性重组质粒,选取阳性重组质粒由大连宝生物工程有限公司测序。
　　
　　1.5同源性比较
　　采用DNAStar软件对分离毒扩增产物(VP3基因)与GenBank中的登录IBDV不同毒株进行核苷酸序列比较,选取的毒株分别是:超强毒为SH95(AY134874)、OKYM(D49 706)、UK661(X92760),弱毒株为JD1(AF321055),经典毒株为52/70(D00869),变异株为GLS(M97346)。
　　
　　2 结果与分析
　　
　　2.1病毒分离
　　鸡胚接种48～120h后陆续死亡,胚体充血,绒毛尿囊膜水肿增厚,尿囊液清亮。
　　
　　2.2分离毒部分特性鉴定
　　2.2.1血凝试验。IBDV-FJ不凝集鸡和鸽子的红细胞,无血凝性,排除了鸡新城疫和禽流感。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　2.2.2人工感染试验。分离毒接种28日龄雏鸡后72h,陆续出现精神不振、羽毛蓬松、接种后4d出现死亡,剖检出现与临床一致的病变,并回收到病毒。
　　2.2.3琼脂扩散试验。分离毒AGP抗原与抗IBDV阳性血清之间出现1条清晰的白色沉淀线,表明被检抗原为IBDV。
　　2.2.4免疫荧光试验。临床采集和人工感染发病鸡法氏囊的冰冻切片与IBDV单抗作用后,在荧光显微镜下均观察到亮绿色荧光病斑。
　　2.2.5RT-PCR鉴定。对提取的病毒RNA进行RT-PCR,扩增得到包含VP3基因全长的特异性目的片段长度约1 041bp,在1%琼脂糖凝胶电泳中分离毒PCR产物出现与IBDV阳性对照大小一致的条带(如图1)。
　　
　　2.3VP3全基因序列同源性比较
　　利用DNAstar分析软件进行序列拼接并经BLAST分析,结果分离毒的扩增产物长度为1 041bp,包含870bp 的VP3全基因序列,其A、T、G、C等4种碱基的比例分别为28.9%、14.9%、26.4%、29.8%,共编码290个氨基酸。将IBDV-FJ VP3基因与GeneBank中已登录IBDV不同毒株进行同源性比较,可见分离毒VP3基因与IBDV 3株超强毒(SH95、OKY M、UK661)和经典毒株(52/70)的核苷酸同源性分别为97.7%～98.2%和95.2%(见表1),初步表明该分离毒为IBDV超强毒株。
　　
　　3结论与讨论
　　
　　(1)本研究从福建省某发病鸡场中疑似传染性法氏囊病的病鸡中分离到1株IBDV毒株(IBDV-FJ),该分离毒无血凝性,在琼脂扩散试验中能与抗IBDV特异性血清出现1条清晰的白色沉淀线;人工感染28日龄雏鸡出现与临床一致的病变,并回收到病毒;应用针对IBDV VP3基因的特异性引物进行RT-PCR,能扩增到长度为1 041bp的特异性目的片段,包含870bp的VP3全基因序列;序列分析发现分离毒VP3基因与IBDV超强毒的核苷酸同源性为97.7%～98.2%,差异小于3%;而与经典毒株、变异株和弱毒株的同源性为94.9%～95.2%,差异大于4%。
　　(2)根据GeneBank中已登录的IBDV不同毒株VP3基因氨基酸序列,分析并推测出超强毒株与其他毒力株(弱毒株、传统毒株和变异株)之间在VP3蛋白氨基酸序列中段存在3个较保守位点(N23、Y116和E141)和3个潜在的变异位点[7](超强毒株为D29、V268和A283,其他毒力病毒株为H29、A268和T283)。本研究分离的IBDV-FJ株VP3氨基酸序列N端有1个位点(D29),C末端氨基酸有2个位点(V268、A283),具有超强毒特征。初步表明,IBDV-FJ株在VP3蛋白氨基酸序列上具超强毒的分子特征,而非传统毒力毒株。这为福建省首次报道。
　　(3)vvIBDV除引起免疫抑制外,其主要特征是致病力明显增强、致死率极高。vvIBDV的抗原性与经典IBDV疫苗株之间无差别,这种毒力变异株能够突破高水平母源抗体,破坏常规疫苗的保护作用,不仅能造成体液免疫抑制,而且对细胞免疫也有一定的影响。分离毒株人工感染雏鸡除引起经典毒株相同的病变之外,还引起感染鸡的法氏囊呈“紫葡萄样”外观、脾脏肿大和胸腺萎缩等病变,与报道的超强毒株[8,9]引起的病变一致。
　　
　　4参考文献
　　
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