甾醇生物合成中的关键酶―环氧角鲨烯环化酶的分子生物学研究:角鲨烯环氧酶

　　摘 要：植物体中环氧角鲨烯环化酶催化2，3－环氧角鲨烯形成一系列三萜烯，为甾醇和三萜化合物的生物合成提供前体，这一催化反应被认为是甾醇和三萜化合物生物合成分支形成的关键位点，综述了甾醇和三萜化合物生物合成中的关键酶――环氧角鲨烯环化酶(OSCs)家族的生物学功能，基因克隆与属性，酶的细胞定位与酶活的表达调控等分子生物学研究进展。
　　关键词：环氧角鲨烯环化酶(OSCs)；甾醇；三萜化合物
　　中图分类号：Q946．5
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2007)01―0010-06
　　
　　植物体中许多次生代谢物产生于乙酸、莽草酸及甲羟戊酸等少数前体，在甲羟戊酸为前体的异戊二烯代谢途径中，又分别以异戊烯焦磷酸、�牛儿苗基焦磷酸、法尼基焦磷酸、�牛儿苗、�牛儿苗基焦磷酸为底物，形成一系列次级代谢分支，两个法尼基焦磷酸缩合形成的三萜角鲨烯被转化成2，3环氧角鲨烯(os)，接下来进行的2，3环氧角鲨烯(OS)环化是三萜化合物和甾醇生物合成的关键性第一步反应，所以，在此形成的甾醇(类固醇)生成支路和五环三萜(烯)生成支路成为基础代谢和次生代谢的分支点(图1)。
　　
　　催化2，3环氧角鲨烯环化形成一系列中间产物的酶，在酶促生物化学研究和酶工业生产上都有重要意义，真核生物中，2，3氧化角鲨烯被环化形成两种不同的三萜化合物：非光合生物中(脊椎动物、真菌)由羊毛固醇合成酶(LS)催化形成羊毛固醇，光合生物中则由环阿屯醇合成酶(CS)催化形成环阿屯醇，两者都是甾醇的合成前体．另外，2，3氧化角鲨烯(OS)在高等植物中还可以环化形成其他结构、功能各异的三萜化合物：齐墩果烷、乌斯烷、羽扇豆烷、达玛烷、木栓烷(friedelane)等，在OSCs分离、纯化，基因的克隆及表达分析上取得的新进展，使人们对酶结构与2，3氧化角鲨烯环化机理有了更深入的了解。
　　
　　1 环氧角鲨烯环化酶(OSCs)家族
　　
　　1．1 甾醇生物合成中的OSCs
　　甾醇生物合成的前体羊毛固醇和环阿屯醇的形成起始于环氧角鲨烯椅-船-椅-船构象的排列，产生中间体C-20原甾醇阳离子，接着这一中间体进行骨架重组形成羊毛固醇框架或环阿屯醇框架(图1)，上述环化反应分别由羊毛固醇合成酶(LS)和环阿屯醇合成酶(CS)催化完成。
　　通常纯化足够量的OSCs来进行氨基酸序列分析或生产抗体是很困难的，植物中环阿屯醇合成酶不仅量很少，而且很难获得具有生物活性的溶解酶．另外，植物中环氧角鲨烯经环化后能产生除环阿屯醇外一种或多种化合物，实验中无法用粗匀浆液来作为单一酶活的研究，近年来，通过对环阿屯醇合成酶的克隆体进行异源表达为解决这一难题带来了希望，但后来的研究发现环阿屯醇在酵母中表达量很少，使得环阿屯醇合成酶基因很难通过互补突变体的方法进行克隆，而植物阿屯醇合成酶代谢突变体又不易获得，一种解决办法就是采用体外饲喂氚标记的氧化角鲨烯底物对酵母提取液中环阿屯醇酶活力进行检测，另一种方法是用接有组成型酵母启动子的植物cDNA文库转化突变体酵母(SMY1)，然后用TLC或HPLC分析环阿屯醇酶的活性，还可以通过合成类似物的方法来仔细研究它们的分子细节，哺乳动物和真菌中，羊毛甾醇合成酶较易获得，动物肝脏和面包酵母匀浆物中都含有丰富的的羊毛甾醇合成酶，可以直接用于酶促反应，而且其中只含有一种变位酶，酶促反应中的产物也是唯一的，因此研究较为深入。
　　随着人们对LS、CS酶序列了解的日益增多，发现这些氨基酸序列中存在极度保守的部分，酵母、人类、老鼠的羊毛固醇合成酶(LS)的cDNA序列就是根据这些保守序列设计简并引物，通过PCR克隆出来的，亚麻(P.sativum)中环阿屯醇合成酶(CS)cDNA的克隆也是如此，cDNA的功能可以通过在LS－缺陷型酵母中来表达确定。
　　
　　1．2 三萜生物合成中的OSCs
　　环氧角鲨烯通过椅-椅-椅-船式构象变化，则形成四环素达玛正离子中间体，在环氧角鲨烯达玛二烯醇合成酶催化下，该正离子生成达玛烷型三萜，四环素达玛正离子还可进一步转化形成羽扇豆正离子或齐墩果正离子，再由它们形成羽扇豆、β-香树素和α-香树素，之后被修饰成五环三萜，三萜合成酶怎样催化形成不同产物的机制还不甚了解。
　　乌斯烷型三萜和齐墩果烷型三萜是两种主要的三萜骨架形式，那么，β－香树素和α－香树素形成的机制就成为首要解决的问题，实际上，环化的差异主要出现在C-19oleanyl正离子阶段，β－香树素和α－香树素合成酶活性位点的保守氨基酸残基可能与C-19 oleanyl正离子形成有关，其中特异氨基酸残基可能决定该正离子的转移特征，β－香树素和口，香树素合成酶的克隆有助于对这两个分支途径的理解。
　　2，3环氧角鲨烯环化形成不同的三萜化合物是由单一或不同的环化酶作用产生，还是环化作用之后一些因子修饰而成?豌豆幼苗叶中β－香树素合成酶和环阿屯醇合成酶的活性变化与固醇和三萜化合物含量的变化一致，说明这两种酶是不同的蛋白，随着人参、豌豆、橄榄、蒲公英、拟南芥等双子叶植物的β－香树素合成酶、羽扇豆合成酶和其它一些多功能三萜合成酶基因的克隆和序列分析，发现三萜合成酶在结构上与其它的环氧角鲨烯环化酶具有相似性，应属环氧角鲨烯环化酶家族中的独立分支，由2，3－环氧角鲨烯环化可产生90多种不同碳架的三萜化合物，而目前只发现三类三萜合成酶：β－香树素合成酶、羽扇豆醇合成酶、混合型香树素合成酶，自然界是否也存在相应数量的三萜合成酶或者是否存在多功能酶已为许多研究者所关注。
　　
　　2 环氧角鲨烯环化酶(OSCs)基因克隆
　　
　　一系列物种的羊毛固醇合成酶(哺乳动物、酵母等)、环阿屯醇合成酶(拟南芥、人参、水稻、豌豆、甘草等)、三种三萜合成酶、两种βAS和一种羽扇豆醇合成酶的cDNA已经报导，基因序列分析表明，在植物环氧角鲨烯环化酶中，三萜合成酶和环阿屯醇合成酶应属环氧角鲨烯环化酶家族中的独立分支，Tania Husselstein-Muller等对拟南芥三萜合成酶基因结构采用“GTX XAG规则”手工分割内含子，结果获得了1种环阿屯醇合成酶(ATCYC)，5种羽扇豆醇合成酶(ATLUP1-5)，和7种5环三萜合成酶(ATPEN1-7)，其中环阿屯醇合成酶基因包含18个外显子，羽扇豆醇合成酶(ATLUP1，2)有17个外显子，五环三萜合成酶(ATPEN1，2)含外显子14个，其它3种羽扇豆醇合成酶(ATLUP3-5)和另外5种环三萜合成酶(ATPEN3－7)也呈现出非常相似的结构，不同的亚族成员其外显子数量变化不大，外显子与内含子之间间隔相似，但内含子数量变化较大，剪接方 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 式在亚族内高度保守，在整个OSCs基因家族中也很保守。
　　氨基酸序列同源性比较发现，环阿屯醇合成酶类氨基酸序列的相似性达到80％，三萜合成酶类具有70％的相似性，与环阿屯醇合成酶间的相似性也达到60％，所有OSCs酶的氨基酸序列中都存在DCTAE和QW高度保守区域。
　　有些三萜合成酶是高度特异性的，如人参卢一香树素合成酶(βAS)和豌豆羽扇豆合成酶(LUS)，而有些则是多功能的，如PSM(豌豆)和IUP1(拟南芥)，PSM的催化产物中β－，香树素和α－香树素的量几乎相等，LUP1催化产物中羽扇豆醇占了绝大部分，β－，香树素只占了少量，另一豌豆β－，香树素合成酶PSY的氨基酸序列与PSM具有78％的同源性，但催化产物却截然不同，β－香树素是PSY催化产生的唯一产物，将PSM的氨基酸序列与已知的3种β－香树素合成酶序列比较发现，PSM中的一些氨基酸序列没有其他3个酶对应部位那样保守，如Leu257被Trp替换，Gln代替Met285，Thr代替Val331，Arg代替His337，而这些部位已被证实与产物类型分化有关，是否由于脂肪族Leu代替芳香族Trp后导致C19的π正离子不稳定，而更有利于在C20处产生更稳定的三级正离子，导致α-香树素的生成，这还有待点突变试验的进一步证实，拟南芥ATLUP2也是一种多功能蛋白，可以催化合成β-香树素和α-香树素(85％)和羽扇豆醇(15％)三种产物，实验表明由人参β-香树素合成酶cDNA的N末端和羽扇豆醇合成酶cDNA的C末端构成嵌合体在酵母中表达，产物中出现β-香树素和羽扇豆醇(3：1)两种三萜，这种一酶多产物现象说明环化过程中有些步骤酶控不严谨，
　　
　　3 环氧角鲨烯环化酶(OSCs)基因的表达调控
　　
　　运用OSCs的不可逆抑制剂和OSCs突变分析发现，高度保守序列DCTAE与底物结合有关，将SCs的DDTAV定点突变成DCTAE，结果导致该酶底物由角鲨烯变成2，3－环氧角鲨烯，IkureAbe and Glenn D.Prestwich(1994)用CNBr降解3H29-MOS标记的小鼠肝OSCs获得一段6 kD高度保守的放射性肽段，该肽段含30个氨基酸，处在蛋白质的C末端，与先前报导的SCs中的活性位点高度同源，为Asp-Asp-Thr-Ala-Glu-Ala，不可逆抑制剂共价结合的位点是两个Asp-Asp残基，抑制剂3H29-MOS可以环化形成21-甲基原甾醇正离子，这个三级烯丙正离子接着被两个相连的Asp亲核攻击，形成酯键造成酶失活，相似的实验也证实了SCs(Alicyclobucillus acidoculdurius)氨基酸序列中的两个Asp残基(DDTAV中376，377位点)对于酶的活化是致关重要的，这些残基分布在酶二聚体的大中心腔内，酵母和植物的OSCs不能被3H29-MOS标记，可能酶中的亲核氨基酸丢失或酶催化过程中没有出现烯丙正离子中间体。
　　Ikuro Abe等(2001)将c.caerulens OSLC的N末端第二个M50作为起始密码子，造成酶结构和活性部位的变化研究其催化产物的变化情况。为此，他们构建了一个截短的重组酶，起始于第二个M，使之在酵母GIL77中表达，结果发现由于N末端的缺失导致酶活的完全丧失，转化细胞的匀浆液抽提物中检测不到环化产物，表明N末端的30个亲水氨基酸残基对于C.caerulens OSLC的酶活是至关重要的。
　　保守区段DCTAEA中负电性的D456被认为是稳定初始化C-20原甾醇正离子的调控位点，Cory等(1996)曾经报导该残基是环氧己烷亲电活化的质子供体，另外，H234被认为是底物结合位点，在维持正离子稳定方面起作用，对S.cerevisiae中OSLC的H234进行点突变研究发现，H234被F替代，或H234A、H234K、H234R、D456N突变体均失去活性，C.caerulens OSLC中D456和H234氨基酸残基对酶的作用与上述情况基本相同，只是H234W和H234K具有少量酶活(5％)，活性位点H234残基的咪唑环可被部分替代，而H234F突变表现失活，表明该酶存在物种差异性。
　　除了氨基酸序列中的DCTAE／DDTAV保守序列外，OSCs和SCs氨基酸序列中还出现了4－8次重复的芳香族氨基酸区域(QW)，研究表明，这些重复序列可能与蛋白质结构稳定性和功能相关，QW区域是负电性的，可能在环化过程中与中间正离子相互作用20。
　　OSCs被认为是引导异戊二烯代谢途径流向甾醇和三萜化合物形成的关键所在，那么对这些酶进行调控就可控制代谢流向19，2，3－环氧角鲨烯环化酶抑制剂研究的比较多22。
　　
　　4 环氧角鲨烯环化酶的空间结构及细胞定位
　　
　　目前还没有研究确定OSCs的二维、三维空间结构，角鲨烯何帕烷环化酶(SHCs)已有这方面的报导，SHCs参与角鲨烯环化产生五环三萜化合物何帕烯，这是原核生物膜中的一个重要组成，细菌中一些SHCs基因已被克隆，OSCs和SHCs的氨基酸序列具有相关性，它们的空间结构可能有相似的地方，革兰式阳性菌AlicyclobuciUus aci－doculdurius的SHCs重建晶体结构是一个二聚体，每个亚基包含两个a螺旋结构域，由此构成一个疏水中心。
　　酵母OSCs亚细胞定位研究起始于30年前，Shechter比较了酵母和哺乳动物OSCs的属性，认为酵母中的酶是可溶的，而哺乳动物的酶连接在微粒上，但是可溶性酵母OSCs的属性又和真正意义上的水溶性胞质酶不尽相同，这些结果表明酵母OSCs可能是部分结合的，只在细胞瓦解和匀浆碎片中变得可溶，从OSCs的氨基酸序列上看，它们不具备信号序列和明显的跨膜结构域，而保留了膜结合的其他变化形式，与这一推论相符的是，SC(来自A.acidocaidarias)酶表面是一个非极性表面，适于插入膜中心，Paola Milla等(2002)通过酶活分析、Western blot及体内Erg7p―GFP(酵母羊毛固醇合成酶)荧光标记实验证明Erg7p几乎完全连接在脂肪颗粒上，其它组织包括内质网中环氧角鲨烯环化酶的量很少，在Erg7p突变体和野生型细胞培养中加入酶的抑制剂，发现Erg7p的底物，环氧角鲨烯大多集中在脂肪颗粒中，他们认为脂肪颗粒不仅是营养脂肪储存位点，还参与甾醇的代谢、运输等。
　　
　　5 展望
　　
　　基因分析得到的OSCs大小约85kD，然而经分离纯化后所的蛋白质实际分子质量要小，比如豌豆中的CS：55kD，βAS：35kD；R.Japonica中的CS：54kD，βAS：26kD，酵母LS：26kD，Nonhernblot分析证实OSCs基因表达序列长度为2-3kb，符合cDNA完全长度范围，造成这种差异的原因是什么，在豌豆中，β－香树素的含量在种子萌发阶段较高，而甾醇的含量要在萌发之后几天才会增加，类似的报道在单子叶植物高粱也有，这种甾醇和三萜含量变化的生物学意义仍不清楚，羊毛固醇合成酶(LS)在抗生素及胆固醇类药物研究开发中已经受到重视，同样，为实现对甾醇生物信号分子和具有植保、特异性药物功能的三萜化合物合成的人工调节，加强对植物环氧角鲨烯环化酶(OSCs)种类、酶催化与产物特异性关系研究具有重要的生物学意义。
　　
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