结核杆菌Ａｇ８５Ｂ基因疫苗的免疫保护效果研究_结核杆菌t细胞免疫反应阳性

　　摘　要：为研究结核杆菌AJ95B基因疫苗的免疫原性和免疫保护效果，将雌性C57BL／6N小鼠32只，随机分为4组，即结核杆菌Ag85B基因疫苗组、BCC组、pcDNA3．1(+)组和PBS组。取各免疫组小鼠脾细胞培养上清检测细胞因子水平；同时进行CTL杀伤活性检测；进一步用结核杆菌H37Rv国际标准强毒株静脉注射攻击小鼠，计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数，对小鼠部分肺和脾组织作病理切片，HE染色观察组织病变程度，Z－N染色检查抗酸杆菌，观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果表明，结核杆菌Ag85B基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果，能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答，细胞因子IFN-y和IL-1分泌增加，IL-4分泌减少，CTL特异性活性增加；使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少，组织病变明显减轻。
　　关键词：结核杆菌；Ag85B；基因疫苗；免疫应答；免疫保护
　　中图分类号：Q78；R378
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2006)02―0128-06
　　近年来，随着人口流动的增加、结核杆菌多重耐药性菌株的出现以及结核病与艾滋病的伴发感染，结核病的疫情再度增高，给全球结核病的防治提出了新的挑战。降低结核病的患病率和死亡率，有效控制结核病，关键在于对结核病的有效预防。自1921年以来，卡介苗(BCG)就广泛应用于结核病的预防，大量的研究表明BCG对儿童原发性结核病具有较好的预防效果，但对结核病主要流行和传播形式的成人结核病，BCG的预防效果较差，因而研制和开发新型高效结核病疫苗对于结核病的有效控制具有十分重要的现实意义。本室构建了含结核杆菌Ag85B基因的真核表达质粒pcDNA3．1(+)-Ag85B能在体外成功表达相应抗原。在此基础上，进一步研究了其在小鼠体内诱导免疫应答的能力和对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果，旨在为研制新型结核病基因疫苗奠定基础。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1．1 材料
　　1．1．1 质粒、菌株和细胞
　　质粒pcDNA3．1(+)和宿主菌JM109均由本室常规保存；质粒pcDNA3．1(+)-Ag85B(含人结核分枝杆菌H37Rv株的Ag85B基因)由本室构建；结核杆菌H37Rv国际标准强毒株有中国药品生物制品检定所提供；EL4／Ag85B细胞(H-2d)为转染pcDNA3．1(+)－Ag85B，并稳定表达Ag85B的EL4细胞。
　　1．1．2 主要试剂
　　去内毒素的质粒提取试剂盒(EndoFreePlas－mid Giga Kit)购自QIAGEN公司，TritonX-100、AMV一步法RT-PCR扩增试剂盒购自上海生工生物工程公司，Tripure试剂(Tripure lsolationReagent)购自Roche公司，乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH-Cytotoxicity Assay Kit)购自日本MBL公司，小鼠细胞因子IFN-y、Ⅱ-2、IL-4 ELISA检测试剂盒购自深圳晶美公司，BCG、结核菌素纯化蛋白衍生物PPD购自成都生物制品研究所。
　　1．1．3 实验动物
　　雌性C57BL／6小鼠，7～8周龄，体重：18―20g，构自中国医学科学院实验动物研究所。
　　1．2 方法
　　1．2．1 结核杆菌Ag85B基因疫苗的制备
　　按去内毒素的质粒提取试剂盒(EndoFreePlasmidGigaKit，QIAGEN公司)说明书提取和纯化去内毒素的pcDNA3．1(+)-Ag85B质粒，分光光度计检测A260进行核酸定量计算，A260260／A280比值检测核酸纯度$，用无菌PBS稀释成1000mg／L。
　　1．2．2 结核杆菌Ag85B基因疫苗免疫小鼠
　　32只C57BL／6健康小鼠，随机分为4组，即结核杆菌Ag85B基因疫苗组、BCG组、pcDNA3．1(+)组和PBS组，每组8只小鼠。在小鼠双侧股四头肌多点注射0．25％Bupivacaine 100μL小鼠肌肉变性第5d，于相应部位多点注射结核杆菌Ag85B基因疫苗100μg，以pcDNA3．1(+)质粒为阴性对照，PBS作为空白对照，每隔3周免疫1次，共3次。卡介苗组尾部皮下注射1μ106CFU卡介苗(BCG)1次，作为阳性对照。
　　1．2．3 免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子的测定
　　第3次免疫后4周，每组处死3只小鼠，无菌条件下取出脾脏，分离脾细胞，细胞浓度5×106／mL，每种3个复孔，每孔中加入PPD(终浓度为1mg／L)，5％CO2孵箱中培养48h(IL-2测定)或72h(1L-4、IFN-y测定)后，收集脾细胞培养上清，用相应的ELISA检测试剂盒检测细胞因子水平。
　　1．2．4 乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定免疫小鼠特异性细胞毒性T细胞(CTL)活性
　　取新鲜制备的免疫小鼠脾细胞4×107接种于细胞培养瓶中，同时按1：4加入经丝裂霉素C去增殖的EL4／Ag85B靶细胞，培养1周作为效应细胞．以转染了质粒pcDNA3．1(+)-Ag85B的EL4细胞作为靶细胞。将效应细胞加在96孔培养板中，设100×104、50×104、10×104／(每孔100μL)3个浓度，每种3个复孔。加1×104／100μL孔的靶细胞悬液到效应细胞中，使效靶比例分别为100：1、50：1、10：1三个浓度，吹打混匀。按说明书分别设立靶细胞自发性释放组(100μL孔靶细胞+100μL孔培养液)，靶细胞最大释放组(100μL孔靶细胞+100μL孔1％TritonX-100溶液，置37℃，90％湿度，5％CO2孵箱中孵育8h．250g离心10min。每孔取100μL细胞培养上清，加入96孔细胞培养板中，于每孔中加入100 μL含酶底物，室温避光孵育30min．将细胞板于酶标仪中测490nm处吸光度。详见LDH-Cytotoxicity Assay Kit使用说明书。
　　1．2．5 结核杆菌H37Rv国际标准强毒株攻击C57BL／6免疫小鼠
　　每组另外5只免疫小鼠经尾静脉注射结核杆菌H37Rv国际标准强毒株1×106菌落形成单位(CFU)，攻击4周后，处死小鼠。无菌操作，取左肺和脾，称重。并精确称取部分含菌组织重量，生理盐水冲洗6次，按1：1(W：V)的比例加入生理盐水，用玻璃匀浆器匀浆，加入等体积4％硫酸处理20min以杀灭其他细菌，少量匀浆液涂片； 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 将匀浆液按一定比例稀释后，接种改良罗氏培养基(1-J培养基)，37℃孵箱中培养4―8周后，进行结核杆菌菌落计数。右肺和脾组织的剩余部分进行固定、石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色，镜检观察组织病理改变，同时进行抗酸染色。
　　1．2．6 统计学分析
　　利用SPSSl0．0统计分析软件，采用‘检验进行组与组之间的分析
　　
　　2 结果
　　
　　2．1 免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子(IFN-y、Il-2、IL-4)的测定(表1)
　　
　　2．2免疫小鼠脾细胞Ag85B基因特异性CTL活性的测定
　　按公式计算细胞毒性百分率，细胞毒性百分率(％)＝[实验组A值-靶细胞自发性释放组A值]／(靶细胞最大释放组A值-靶细胞自发性释放组A值)]×100％．结果显示，效靶比为100：l、50：1、10：1时，结核杆菌Ag85B基因疫苗组的细胞毒。性百分率分别为55．3％、35．7％、9．2％，BCG组的细胞毒性百分率分别为28．9％、21．4％、9．8％，结核杆菌Ag85B基因疫苗组的细胞毒性百分率高于BCG免疫组、pcDNA3．1(+)阴性对照组和PBS空白对照组(p 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文