百合多糖的含量测定及抗氧化活性研究 多糖抗氧化

　　摘要：采用热水浸提法从百合中提取百合多糖，蒽酮－硫酸法测定百合多糖的含量，对百合多糖的抗氧化活性进行了初步研究。结果表明，百合粗多糖中多糖含量达到了５２．９６％；在不同的抗氧化体系中百合多糖均有一定的抗氧化活性，并且抗氧化活性与百合多糖的浓度呈一定的量效关系；对比维生素Ｃ试剂可知，在试验浓度范围内，百合多糖对Ｏ２－・和・ＯＨ的清除能力与维生素Ｃ相当，对ＮＯ２－的清除能力约为维生素Ｃ的１／５，还原能力约为维生素Ｃ的１／２５。
　　关键词：百合多糖；含量测定；抗氧化活性
　　中图分类号：Ｏ６５６．３４文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2954-03
　　
　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｆ Ｌｉｌｙ ａｎｄ Iｔｓ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ
　　
　　ＬＩ Ｌｉ－ｈｕａ
　　（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈａａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｚｈｏｎｇ ７２３００１，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Wａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ in ｌｉｌｙ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｎ ｈｏｔ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ａｎｔｈｒｏｎｅ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｔｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ｌｉｌｙ ｒｅａｃｈｅｄ ５２．９６％． Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｓｓａｙｓ ｒｅｌａｔｅｄ to ｉｔｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ． Ｉｔｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ （Ｏ２－・） ａｎｄ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ（・ＯＨ） ｗａｓ ｅｑｕａｌ ｔｏ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ， ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｎｉｔｒｉｔｅ（ＮＯ２－） waｓ １／５ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ， ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ａｂｏｕｔ １／２５ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： lｉｌｙ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ
　　
　　百合又称菜百合，为百合科百合属中能形成鳞茎的栽培种群，多年生宿根草木植物。百合不仅是营养保健食品，而且具有良好的药用价值，是卫生部审批通过的药食两用植物。现代分析表明，百合主要含秋水仙碱等多种生物碱和蛋白质、脂肪、淀粉、钙、磷、铁及维生素Ｂ１、维生素Ｂ２、维生素Ｃ、β－胡萝卜素等营养物质，具有良好的滋补功效。中医认为，百合味甘微苦，性平，入心，肺经，有润肺止咳，清心安神之功，可用于热病后余热未清，虚烦惊悸，神志恍惚和肺痨久咳、咳血，肺脓疡等［１］。
　　多糖是百合中的主要功能成分之一，具有抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、降血糖、抗病毒、降血脂、抗凝血等生理功能，近年来已成为天然药物研究的一个热点［２］。目前，对百合多糖的研究多集中在多糖的提取工艺及多糖的分离纯化［３，４］，对百合多糖含量的测定及抗氧化活性方面的文献较少［５］。本研究采用热水浸提法提取百合多糖，蒽酮－硫酸法测定多糖的含量，通过四个不同的抗氧化体系对百合多糖的抗氧化活性进行评价，并与合成抗氧化剂维生素Ｃ对照，将为研究百合多糖的药理作用以及开发利用百合多糖提供一定的科学依据。
　　１材料与方法
　　１．１材料与试剂
　　百合：购于汉中国大药房（经陕西理工学院生物学院植物学教研室鉴定）；取适量百合样品，放入烘箱低温烘干，粉碎过４０目筛备用。
　　邻苯三酚，邻菲罗啉，无水乙醇，亚硝酸钠，双氧水，硫酸亚铁，三氯化铁，三羟甲基氨基甲烷，２ ｇ／Ｌ蒽酮溶液（称取０．２ ｇ蒽酮，加入质量分数为９８％的浓硫酸１００ ｍＬ，混合摇匀，置于棕色瓶中，冰箱保存）；葡萄糖，铁氰化钾，三氯乙酸，柠檬酸，对氨基苯磺酸，盐酸萘己二胺等均为国产分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
　　１．２仪器
　　ＧＲ－２００电子分析天平（日本Ａ＆Ｄ公司）；１０１型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；７２２Ｎ型可见分光度计（上海精密科学仪器有限公司）；ＴＤＬ－５台式离心机（上海安亭科学仪器制造厂）； ＳＨＺ－Ｄ（ＩＩＩ）循环水式真空泵（巩义市豫华仪器有限责任公司）。
　　１．３方法
　　１．３．１粗百合多糖的提取取一定量预处理的百合样品，按料液质量比１∶１０加入９５％（Ｖ／Ｖ）乙醇常温下浸泡１２ ｈ，过滤。滤渣按料液质量比１∶３０加蒸馏水［６］，８０℃水浴保温２ ｈ，减压抽滤，滤渣重复浸提得二次滤液，合并滤液，浓缩，加入３倍浓缩液体积的９５％（Ｖ／Ｖ）乙醇，置４ ℃冰箱中过夜，待絮状凝胶物和粒状沉淀析出后，以３ ０００ ｒ/min离心２０ ｍｉｎ，弃上清，沉淀经复溶、离心、过滤后，依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，冷冻干燥得百合多糖粗提物，待用。
　　１．３．２粗百合多糖的含量测定多糖的测定方法［７］有蒽酮－硫酸法、高效液相色谱法、苯酚－硫酸法、酶法等。本文采用蒽酮－硫酸法，测定原理是多糖类化合物在浓硫酸的作用下水解为单糖，并迅速生成糠醛衍生物，糠醛衍生物再与蒽酮结合成有色化合物，在一定范围内，其颜色深浅与多糖的含量成线性关系，可用比色法在一定波长下测定多糖的含量。称取蒽酮５０ ｍｇ，置于锥形瓶中，加蒸馏水２５ ｍＬ溶解，然后加入硫酸７５ ｍＬ，即得，现配现用。
　　１．３．３标准曲线的绘制精密称取１０５ ℃下干燥恒重的分析纯葡萄糖０．０１０ ２ ｇ，以水溶解后定容于１００ ｍＬ容量瓶中，配制浓度为０．１０２ ｍｇ／ｍＬ葡萄糖标准溶液。分别准确移取葡萄糖标准溶液０．１、０．２、０．４、０．６、０．８和１．０ ｍＬ于１０ ｍＬ比色管中，加水补足至１.0 ｍＬ。在冰水浴中迅速加入２ ｇ／Ｌ蒽酮溶液４ ｍＬ，摇匀，在沸水浴中加热８ ｍｉｎ，取出，自来水冷却至室温后在１０ ｍｉｎ内于波长５８５ ｎｍ下测定吸光度，以蒸馏水代替样液作空白，以葡萄糖含量为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线并计算回归方程和相关系数。
　　１．３．４百合多糖的含量测定分别精密称取０．１０ ｇ百合多糖粗提物３份，用蒸馏水溶解后定容至１００ ｍＬ，准确吸取０．４ ｍＬ稀释液于１０ ｍＬ比色管中，后续步骤同１．３．３“加水补足至１.0 ｍＬ”。比色后，通过回归方程计算得到粗提物溶液中多糖浓度Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）以及百合多糖在粗提物中的百分含量和ＲＳＤ值。
　　１．３．５百合多糖对超氧自由基（Ｏ２－・）的清除作用采用邻苯三酚自氧化法［８］。在碱性条件下，邻苯三酚迅速发生自氧化，生成红色中间产物，同时释放出Ｏ２－・，Ｏ２－・可加速邻苯三酚自氧化速率。当有清除剂存在时，可清除Ｏ２－・，从而阻止中间产物的积累，通过比色法检验物质清除Ｏ２－・的能力。测定步骤为：取０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ值为８．２的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液６ ｍＬ，加入盛有２．２ ｍＬ蒸馏水的试管中，置２５ ℃水浴中预热２０ ｍｉｎ，分别精确吸取不同浓度的粗百合多糖液０．５ ｍＬ，立即加入在２５ ℃水浴中预热的７ ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯三酚（由１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ配制）１ ｍＬ，立即混匀，在２５ ℃水浴中准确反应４ ｍｉｎ后，加入８ ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ溶液０．１ ｍＬ终止反应，并测定３２０ ｎｍ处的吸光值。配制同浓度的维生素C溶液做阳性对照，按下式计算清除率：Ｏ２－・清除率＝（Ａ空白－Ａ样品）／Ａ空白×１００％。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　１．３．６百合多糖对羟基自由基（・ＯＨ）的清除作用参照Ｆｅｎｔｏｎ反应法建立・ＯＨ自由基体系模型［９］。Ｈ２Ｏ２与Ｆｅ２＋混合后产生・ＯＨ的Ｆｅｎｔｏｎ反应为：Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ２＋＝ＯＨ－＋・ＯＨ＋Ｆｅ３＋，・ＯＨ反应活性高，存在时间短，若体系中加入邻二氮菲，能有效捕捉・ＯＨ并产生有色产物，产物在５３６ ｎｍ处有强吸收，加入清除剂后，便会与邻二氮菲竞争结合・ＯＨ，从而使有色产物的生成量减少，降低溶液在５３６ ｎｍ处的吸光度值。因此可通过测定添加试样前后吸光度来判定试样的清除效果。测定步骤为：依次加入邻二氮菲１．５ ｍＬ，ｐＨ值为 ７．４的磷酸盐－生理盐水缓冲液３．８ ｍＬ及不同浓度的粗百合多糖液０．５ ｍＬ（损伤管及未损伤管不加多糖溶液）混匀，再加硫酸亚铁溶液１．５ ｍＬ，立即混匀，最后加双氧水１ ｍＬ（未损伤管不加）。最终浓度邻二氮菲０．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ、硫酸亚铁溶液０．７５ ｍｍｏｌ／Ｌ、双氧水０．０１％（Ｖ／Ｖ），总体积９ ｍＬ（不足用蒸馏水补足）。把各管置于３７ ℃恒温水浴箱保温６０ ｍｉｎ，分别测定各管Ａ５３６ｎｍ值。配制同浓度维生素C溶液做阳性对照，按下式计算清除率：・ＯＨ清除率＝（Ａ样品－Ａ损伤）/（Ａ未损－Ａ损伤）×１００％。
　　１．３．７百合多糖对亚硝酸盐（ＮＯ２－）的清除作用亚硝酸钠在弱酸性条件下，与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合，生成的红色化合物在５４４ ｎｍ处有特征吸收峰，加入清除剂后，可有效清除ＮＯ２－，使亚硝酸钠含量减少，从而使红色化合物生成减少，吸光度值下降，可通过添加试样前后吸光度值的变化判定试样对ＮＯ２－的清除效果［１０，１１］。测定步骤为：分别精确吸取不同浓度的粗百合多糖液３ ｍＬ于２５ ｍＬ容量瓶，加入５ μｇ／ｍＬ的亚硝酸钠标准液３ ｍＬ，柠檬酸－磷酸缓冲液（ｐＨ值３．０）５ ｍＬ，３７ ℃水浴中反应１５ ｍｉｎ后，立即加入２ ｍＬ ４ ｇ／Ｌ对氨基苯磺酸溶液混匀，静置３～５ ｍｉｎ，加入２ ｇ／Ｌ盐酸萘己二胺溶液１ ｍＬ，用蒸馏水定容至２５ ｍＬ，静置１５ ｍｉｎ后，测定５４４ ｎｍ处吸光值。配制不同浓度的维生素C溶液做阳性对照，按下式计算清除率：
　　ＮＯ２－清除率＝（Ａ未加提取液－Ａ加提取液）／Ａ未加提取液×１００％。
　　１．３．８百合多糖还原能力的测定采用普鲁士兰法［１２］。其原理是试样将赤血盐［Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６］还原成黄血盐［Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６］，黄血盐再与Ｆｅ３＋作用，生成普鲁士蓝，在７００ ｎｍ波长测定吸光值，以检测普鲁士蓝的生成量来衡量试样的还原能力，吸光值愈高，表示试样的还原能力愈强。测定步骤为：分别精确吸取不同浓度的粗百合多糖液２ ｍＬ，加入ｐＨ值为６．６的磷酸盐缓冲液２．５ ｍＬ和１０ ｇ／Ｌ的铁氰化钾溶液２．５ ｍＬ，摇匀并定容至１０ ｍＬ，在５０ ℃保温２０ ｍｉｎ，急速冷却，加入１０％（Ｖ／Ｖ）的三氯乙酸２．５ ｍＬ，混匀后以３ ０００ ｒ/min离心１０ ｍｉｎ，取上清液２．５ ｍＬ，加蒸馏水２．５ ｍＬ和１ ｇ／Ｌ的三氯化铁溶液０．５ ｍＬ，室温放置１０ ｍｉｎ后，测定７００ ｎｍ处的吸光值，吸光值越大，表明还原能力越强。配制不同浓度的维生素C溶液做为对照。
　　2结果与分析
　　2．１标准曲线的测定和回归方程的建立
　　由图１的标准曲线得到回归方程为：Ａ＝９．９６９ ９Ｘ＋０．００６ ９，r＝０．９９９ ３。
　　2．３．２百合多糖对・ＯＨ的清除作用
　　按照１．３．６的方法，得到多糖溶液、对照品维生素Ｃ对羟基自由基（・ＯＨ）的清除作用如图３所示。由图３可知，不同浓度的多糖溶液和维生素Ｃ都具有一定的清除・ＯＨ的能力，并呈一定的量效关系；在试液浓度为１．０ ｍｇ／ｍＬ时，多糖对・ＯＨ的清除能力最强，清除率几乎达到６５％，相同浓度维生素C的清除率为７２．７％，由此可看出百合多糖对・ＯＨ表现出较强的清除作用，与维生素C试剂相当。
　　2．３．３百合多糖对ＮＯ２－的清除作用按照１．３．７的方法得到多糖溶液、对照品维生素Ｃ对ＮＯ２－的清除作用如图４、图５所示。由图４、图５可得，不同浓度的多糖溶液和维生素Ｃ对ＮＯ２－都有清除作用，清除率均随着浓度的增加而增强；在试验浓度范围内，多糖浓度为１．０ ｍｇ／ｍＬ时对ＮＯ２－的清除率达到最大，为５５．１％，对照品维生素Ｃ在试验浓度范围内的最大清除率为５９．１％，相应浓度为０．２０ ｍｇ／ｍＬ，由清除率可看出多糖与维生素Ｃ清除率相当，对比浓度可知，多糖浓度均为相应维生素Ｃ浓度的近５倍，由此表明，百合多糖对ＮＯ２－的清除能力不及维生素Ｃ，约为维生素Ｃ试剂的１／５。
　　2．３．４百合多糖的还原能力按照1.3.8的方法得到多糖溶液、对照品维生素Ｃ还原能力的变化趋势如图６、７所示。由图６、７可知，多糖、维生素Ｃ的还原能力均与各自的浓度呈正相关，多糖和维生素Ｃ在试验浓度范围内的最大吸光度值分别为０．４２５、０．４８９，而多糖浓度约为相应维生素Ｃ浓度的２５倍，说明百合多糖的还原能力低于维生素Ｃ，约为维生素C试剂的１／２５。
　　3结论
　　１）采用９５％（Ｖ／Ｖ）乙醇对百合提前浸泡，以除去单糖、低聚糖等干扰成分，再用蒸馏水８０ ℃浸提百合中的活性多糖，蒽酮－硫酸比色法测定粗多糖中多糖的含量，结果表明百合粗提物中的多糖平均含量为５２．９６％，ＲＳＤ值为０．９６％。
　　２）抗氧化活性试验结果表明，百合多糖在不同的抗氧化体系中均表现出一定的抗氧化活性，并且抗氧化活性随着浓度的增加而增强；对比维生素Ｃ试剂可知，在试验浓度范围内，百合多糖对Ｏ２－・的清除能力与维生素C试剂接近，但稍低于维生素Ｃ，对・ＯＨ的清除作用与维生素Ｃ试剂相当，对ＮＯ２－的清除能力不及维生素Ｃ，约为维生素Ｃ试剂的１／５，百合多糖的还原能力低于维生素Ｃ，约为维生素Ｃ试剂的１／２５。
　　
　　参考文献：
　　［１］ 赵秀玲．百合的营养成分与保健作用［Ｊ］．中国林副特产，２００９（５）：１０１－１０２．
　　［２］ 胡敏敏，蔡宝昌，张志杰，等． 百合多糖的药效学研究［Ｊ］． 中药新药与临床药理，２００７，１８（２）：１０１－１０２．
　　［３］ 陈小蒙，刘成梅，刘伟． 龙牙百合多糖的纯化及其分子量的测定［Ｊ］． 食品科学，２００８，２９（１１）：３０５－３０７．
　　［４］ 杨林莎，李玉贤，李秋杰，等． 百合多糖提取、纯化工艺优选［Ｊ］． 中医研究，２００５，１８（１）：２５－２７．
　　［５］ 滕利荣，孟庆繁，刘培源，等． 酶法提取百合多糖及其体外抗氧化活性［Ｊ］． 吉林大学学报（理学版），２００３，４１（４）：５３８－５４２．
　　［６］ 唐青， 郁建平． 猪肚菇水溶性多糖提取工艺的研究［Ｊ］． 食品科学，２００８，２９（２）：１８０－１８２．
　　［７］ 梁丽军，曾哲灵，熊淘， 等． 蒽酮－硫酸法测定大蒜多糖的含量［Ｊ］． 食品科学，２００８，２９（９）：４９９－５０２．
　　［８］ 张晓强，浦跃朴，尹立红，等． 冬虫夏草及人工虫草菌丝体对超氧阴离子自由基和羟自由基清除作用的实验研究［Ｊ］． 中国老年学杂志，２００３，２３（１１）：７７３－７７５．
　　［９］ 齐亚娥，吴冬青，安红钢，等． 玫瑰花蕾黄酮类化合物提取及清除羟自由基能力［Ｊ］． 食品科技，２００７，３２（４）：８２－８５．
　　［１０］ 赵二劳，王晓妮，张海容，等． 山楂清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究［Ｊ］． 食品与发酵工业，２００６，３２（１０）：２９－３１．
　　［１１］ 孙鹏，徐璨璨，孙先锋． 大蒜浸提液对亚硝酸盐清除作用的效果分析［Ｊ］． 湖北农业科学，２００９，４８（３）：７０２－７０４．
　　［１２］ 周海华，马海乐．云芝多糖的体外抗氧化活性研究［Ｊ］． 食品研究与开发，２００８，２９（３）：４４－４８．
　　
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文