[抗莱克多巴胺多克隆抗体的制备]莱克多巴胺

　　摘要：为了制备抗莱克多巴胺多克隆抗体，试验通过连接剂ｂｕｔａｎｅ－１，４－ｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｙｄｙｌ ｅｔｈｅｒ把莱克多巴胺和载体蛋白ＢＳＡ和ＯＶＡ偶联成免疫抗原和包被抗原，免疫新西兰大白兔，饱和硫铵沉淀方法纯化抗体，间接ＥＬＩＳＡ法检测抗血清效价。结果通过免疫兔获得了抗莱克多巴胺的多克隆抗体。经ＥＬＩＳＡ测定，其效价为１∶１２ ８００。
　　关键词：莱克多巴胺；多克隆抗体；ＥＬＩＳＡ
　　中图分类号：Ｓ８５９．８４ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1836-02
　　
　　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
　　
　　ＺHANG Ｈｏｎｇ－ｌｉｎ１，ＣHEN Ｃｈａｎｇ－ｙｕｎ１，ＺHOU Ｈｏｎｇ－ｘｉａ１，ＹU Ｘｉａｏ－ｌｉａｎ１，ＹANG Ｊｉａｎ－ｂｏ２，ＳHI Ｇｕｏ－ｑｉｎｇ２
　　（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｘｉａｏｚｈｕａｎｇ University，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１１７１，China；
　　２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ， Ｓｈｉｈｅｚｉ ８３２０００，Ｘｉｎｊｉａｎｇ，China）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ＲＣＴ （Ｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅ） ｗａｓ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ＢＳＡ ａｎｄ ＯＶＡ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ａｎｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｂｕｔａｎｅ－１， ４－ｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｙｄｙｌ ether， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎing Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｉｔｈ ＢＳＡ－ＲＣＴ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｉｔｓ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｔｉｔｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ pｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＲＣＴ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｗａｓ １∶１２ ８００．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅ； ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ； ＥＬＩＳＡ
　　莱克多巴胺（Ｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅ，ＲＣＴ）是苯酚胺类β２肾上腺素激动剂，具有β２兴奋剂的所有功效［１－４］，其对人体危害性很大。随着克伦特罗等一类β２兴奋剂被世界各国禁止作为饲料添加剂使用［5，6］，莱克多巴胺的非法滥用日趋严重。ＲＣＴ可显著提高肥育猪的生产性能，改善饲料利用效率，显著提高猪的瘦肉率，在猪体内代谢较克伦特罗迅速而更加不易检测［7，8］。目前，欧盟和我国禁止将莱克多巴胺作为饲料添加剂使用。因此，建立快速、有效的检测方法迫在眉睫。酶联免疫吸附检测法（ＥＬＩＳＡ）是一种快速检测方法，不需要复杂的仪器设备，灵敏度高，特异性强，样品前处理简单，非常适合大量样品的检测，便于现场监控［９］。ＥＬＩＳＡ检测莱克多巴胺残留国外已有报道［6，９］，且已经有莱克多巴胺残留检测的ＥＬＩＳＡ商品化试剂盒问世。国内已有建立ＥＬＩＳＡ方法检测研究报道，但没有形成商品化的试剂盒［１０］。目前我国使用的试剂盒主要是从国外进口，价格昂贵，不利于推广使用。本试验通过连接剂ｂｕｔａｎｅ－１，４－ｄｉｏｌｄｉｇｌｙｃｉｙｄｙｌ ｅｔｈｅｒ把莱克多巴胺和载体蛋白ＢＳＡ和ＯＶＡ偶联成免疫抗原和包被抗原，然后制备抗ＲＣＴ的多克隆抗体，为莱克多巴胺的免疫检测奠定基础。
　　１材料
　　１．１试剂
　　盐酸莱克多巴胺（纯度９７．２％，南京师范大学惠赠）； ｂｕｔａｎｅ－１，４－ｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｙｄｙｌ ｅｔｈｅｒ；酶标山羊抗兔ＩｇＧ－ＨＲＰ （武汉博士德公司）。
　　１．２试验动物
　　雄性新西兰大白兔，体重１．５ｋｇ，购自南京某实验动物中心。
　　１．３主要仪器
　　酶标仪、自动洗板机（美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ）；高速冷冻离心机（美国Ｔｈｅｒｍｏ）；电泳仪（北京六一仪器厂）。
　　２试验方法
　　２．１抗原制备
　　采用文献［１０］介绍的方法先将ＲＣＴ・ＨＣｌ转变成半琥珀酸酯，再用混合酸酐法分别与ＢＳＡ和ＯＶＡ偶联制备免疫抗原（ＢＳＡ－ＲＣＴ）和包被抗原（ＯＶＡ－ＲＣＴ）。
　　２．２抗体的制备
　　取３只体重约１．５ ｋｇ的健康大耳兔，在动物房观察饲养一周。将２ ｍＬ免疫原（ＲＣＴ－ＢＳＡ，１ ｍｇ／ｍＬ）与等量的弗氏完全佐剂用注射器对抽法按体积比１∶１混合成油包水乳浊液，混合并充分乳化。首免每只兔接种０．２５ ｍｇ免疫原，背部皮下多点注射。以后换用弗氏不完全佐剂，剂量、方法同首免，每隔两周加强免疫一次；从第三次免疫后开始，每次免疫后７ ｄ左右，用１ ｍＬ无菌注射器从耳边缘静脉取血０．５ ｍＬ左右，用间接ＥＬＩＳＡ法测定血清效价。当血清效价不再增加时，心脏采血２０ ｍＬ，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，分离血清，用以检测抗体效价，－２０℃储存备用。
　　２．３抗ＲＣＴ多克隆抗体的鉴定
　　２．３．１最佳包被浓度的确定将ＢＳＡ－ＲＣＴ梯度稀释为２００、１００、５０、１０、５ μｇ／ｍＬ，按每孔１００ μＬ包被酶标板，４℃包被过夜，自动洗板机洗涤；封闭，３７℃ ３０ ｍｉｎ；洗涤，加入１∶２００稀释的抗血清，３７℃反应
　　１ ｈ；洗涤，加入１００ μＬ酶标羊抗兔抗体，３７℃反应
　　１ ｈ；洗涤，加１００ μＬ ＴＭＢ底物液，３７℃避光反应２０ ｍｉｎ；加５０ μＬ ２ mol/L Ｈ２ＳＯ４终止反应，用酶标仪检测ＯＤ４５０值。取ＯＤ４５０值为１．０左右时的包被浓度为最佳浓度。
　　２．３．２抗体的纯化用饱和硫酸铵法纯化抗ＲＣＴ多克隆抗体［９］。
　　２．３．３抗体效价测定用间接ＥＬＩＳＡ测定抗ＲＣＴ抗体效价，以最佳包被抗原浓度包被酶标板，从
　　１∶１００开始梯度稀释抗血清，按２．３．１的ＥＬＩＳＡ步骤操作。以Ｐ／Ｎ＞２（Ｐ为阳性血清的ＯＤ４５０值，Ｎ为阴性血清的ＯＤ４５０值），说明有抗体产生。
　　３结果与分析
　　３．１抗血清的鉴定
　　３．１．１最佳包被浓度的确定由表１可见，经测定，ＢＳＡ－ＲＣＴ为１００μｇ／ｍＬ时，ＯＤ４５０值为１．０００。因此确定１００ μｇ／ｍＬ为最佳包被浓度。
　　３．２．２抗体纯化结果由图１可见，纯化后的抗体呈现出一条条带，相对分子质量约为６６ kＤ，说明纯化后抗体纯度很高且没有杂物。
　　
　　３．２．３抗ＲＣＴ抗体效价测定经间接ＥＬＩＳＡ法测定，抗ＲＣＴ的抗体效价为１∶１２ ８００。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　３．２．４抗体产生规律经初次和两次加强免疫后，抗体效价逐渐升高。初次免疫７ ｄ后检测其抗体效价，Ｐ／Ｎ＜２，说明没有抗体产生，随着免疫次数的增多，逐渐产生抗体，至加强免疫２次后１４ ｄ，产生的抗体最多，抗体效价也达到了最高水平（图２），经间接ＥＬＩＳＡ法检测其效价为１∶１２ ８００。这为以后研制莱克多巴胺的免疫学检测试剂盒及深入研究莱克多巴胺的免疫学检测技术奠定了坚实的基础。
　　参考文献：
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