黔北【黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因ｃＤＮＡ克隆与生物信息学分析】
摘要：选择与羊同源性较高的牛ＲＥＲＧＬ基因组序列设计特异性引物，提取黔北麻羊脾脏总ＲＮＡ，通过ＲＴ-ＰＣＲ技术对ＲＥＲＧＬ基因进行克隆测序及序列分析。结果表明，成功克隆了黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因，其ｃＤＮＡ序列６４６ ｂｐ，ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＪＮ ６７１９１９，编码２０５个氨基酸。生物信息学分析表明，黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因蛋白二级结构α－螺旋占４０．６8％，延伸链占１６．１８％，无规则卷曲占４３．１４％；没有跨膜螺旋结构域且没有糖基化位点。
关键词：黔北麻羊；ＲＥＲＧＬ基因；克隆；生物信息学分析
中图分类号：Ｓ８２７；Ｑ８１１．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）15－3362-04
cDNA Sequence Cloning of RERGL Gene of Qianbei Ma Goat and Bioinformatics Analysis
ＣＡＩ Ｈｕｉ-ｆｅｎ，ＣＨＥＮ Ｚｈｉ，ＬＵＯ Ｗｅｉ-ｘｉｎｇ，ＬＩＵ Ｒｕｏ-ｙｕ，ＺＨＡＮＧ Ｙｉ-ｙｕ，ＳＨＩ Ｚｈａｏ-ｙｉｎｇ
（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｌａｔｅａｕ Ｍｏｕｎｔａｉｎｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ／Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｇｏａｔ ＲＥＲＧＬ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｉｃ ｇｅｎｅ ｏｆ ｏｘ． Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｑｉａｎｂｅｉ Ｍａ ｇｏａｔ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｐｌｅｅｎ． Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＲＥＲＧＬ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ （ＲＴ－ＰＣＲ） ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＲＥＲＧＬ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｑｉａｎｂｅｉ Ｍａ ｇｏａｔ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｌｏｎｅｄ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ６４６ ｂｐ， ｅｎｃｏｄｉｎｇ ２０５ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ； ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ｗａｓ ＪＮ ６７１９１９． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ the ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＲＥＲＧＬ ｗａｓ ４０．６8％ α－ｈｅｌｉｘ ＋１６．１８％ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｃｈａｉｎ＋４３．１４％ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ． Ｎｏ ｔｒａｎｓ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｘ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｑｉａｎｂｅｉ Ｍａ ｇｏａｔ； ＲＥＲＧＬ ｇｅｎｅ； ｃｌｏｎｅ； ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ
ＲＥＲＧＬ基因属于Ｒａｓ超家族基因。Ｒａｓ超家族是一类重要的功能蛋白。它们介导生长因子、细胞因子和多种细胞外信号的通路，对细胞生长、分化、存活、增殖等多种功能的调节发挥重要作用［１］。Ｒａｓ超家族在细胞信号转导中可作为信号转换器或分子开关，它们通过与ＧＴＰ结合（激活态）和ＧＤＰ结合（失活态）的转换导致信号的转导或终止［２］。ＲＥＲＧＬ与部分Ｒａｓ超家族成员的同源性可达４０％～５０％。其蛋白与ＲＥＲＧ（Ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｄ ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）蛋白功能高度相似。
黔北麻羊是贵州省三大优良山羊品种之一。其历史悠久，具有耐粗饲、繁殖率高、产肉性能良好、膻味轻、肉鲜美可口、板皮品质优良等优点，为当地群众所喜养［３］。罗卫星等［４］对黔北麻羊的肉用性能和肉质特征进行研究，表明黔北麻羊肉用性能和肉质性质良好，具有很好的开发价值。在分子水平上，关于黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因的研究国内外尚未见报道。本研究以黔北麻羊为研究对象，通过分子克隆技术对ＲＥＲＧＬ基因ｃＤＮＡ进行克隆后测序，并对结果进行生物信息学分析，以期为进一步开展黔北麻羊ＲＥＲＧＬ基因的表达调控以及与生长性状相关分析研究提供一定的理论基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
从贵州省习水县采集成年黔北麻羊的脾脏，液氮中保存备用。
１．２ 试剂和载体
ＲＮＡ提取试剂盒（Ｔｒｉｚｏｌ）购自ＭＢＩ公司；ＬＢ培养基；氨苄青霉素（Ａｍｐ）（１００ ｇ／Ｌ）；１０×ＴＢＥ缓冲液；ＤＥＰＣ和琼脂糖购自ＳＩＧＭＡ公司；ｐＭＤ１８-Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ、反转录试剂盒（ＤＲＲ０３７Ａ）、Ｔａｑ酶和ｄＮＴＰ购自大连ＴａＫａＲａ公司；菌种ＴＧ１、ＤＬ ２０００ Ｍａｒｋｅｒ、去离子甲酰胺、引物及其他常用试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
１．３ 提取ＲＮＡ前的准备工作
玻璃制品用０．１ Ｍ的ＮａＯＨ浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用去离子水冲洗２遍，１８０ ℃烘烤６ ｈ；研钵、电泳槽等用０．１％的ＤＥＰＣ水冲洗浸泡，由于未灭活的ＤＥＰＣ对ＰＣＲ反应有影响，可用０．５ ％的ＳＤＳ处理；Ｔｉｐ头、ＥＰ管用０．１ ％的ＤＥＰＣ水浸泡过夜，高压灭菌使ＤＥＰＣ失活，烘干备用；提取前在超净工作台紫外照射１５ ｍｉｎ。
１．４ 总ＲＮＡ的提取及质量、浓度测定
根据ＲＮＡ提取试剂盒说明书用Ｔｒｉｚｏｌ法提取黔北麻羊脾脏总ＲＮＡ。用１％琼脂糖凝胶检测总ＲＮＡ的完整性，核酸蛋白测定仪测定浓度，－８０ ℃保存备用。