基因序列及其扩增的引物【弓１虫ＲＨ株ＳＡＧ１基因序列体外扩增及生物信息学分析】

　　摘 要：根据SAG1基因序列，自行设计一对寡核苷酸引物。利用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中成功扩增出编码SAG1抗原的基因片段，扩增出的基因片段大小与预期长度(1006bp)相符，结果经测序验证，并利用生物信息学方法对SAG1蛋白理化性质、结构和功能进行了预测。
　　关键词：弓形虫；SAC1基因；体外扩增；生物信息学分析
　　中图分类号：R382.5　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0348-04
　　
　　弓形虫(Toxop1asma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫，可感染包括人类在内的所有哺乳动物的有核细胞，正常人感染弓形虫后，多呈无症状带虫免疫状态，但孕妇感染后，则可致流产、死胎以及胎儿先天畸形，弓形虫作为一种重要的机会性致病原虫，已成为导致免疫缺陷患者死亡的主要原因之一，sAC1是刚地弓形虫速殖子主要表面抗原之一，其分子质量约为30kD，研究表明3AC1在弓形虫入侵宿主的过程中发挥了双重作用，它不仅在介导弓形虫速殖子入侵宿主细胞的过程中发挥了重要作用，而且还可引发宿主体内强烈的抗原抗体反应，此种免疫原性特质，使其成为诊断性抗原与免疫性抗原的重要候选基因，本文根据RH株54C1基因序列参考相关文献设计并合成了一对寡核苷酸引物，采用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码SAC1基因片段，并对其进行序列测定及生物信息学分析，为进一步通过基因工程进行表达做准备，同时也为体外研究弓形虫SAC1基因的结构与功能及其在免疫诊断学中的应用打下了基础。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1．1　材料
　　1．1．1　主要试剂及工具酶
　　TaqDNA聚合酶(Takara公司)；dNTPs、蛋白酶K(上海生物工程公司)；Tris碱、SDS、EDTA、酚、氯仿均为国产分析纯。
　　1．1．2　虫株
　　弓形虫RH株由中山大学医学院陈观今教授惠赠。
　　1．1．3　实验动物
　　SPF级昆明小鼠，6～8周龄，18～20g，购于广东医学实验动物中心。
　　
　　1．2　方法
　　1．2．1　引物的设计与合成
　　根据GenBank中弓形虫54C1基因序列(序列号：S76248)311～1321位，设计一对引物P1和P2，P1：5"-ATGTCGGTTTCGCTGCACCACTT-3，，P2:5-TACGCGACACAAGCTGCGATAGAGCC-3"，引物由上海生工合成，并经PAGE纯化。
　　1．2．2　弓形虫基因组DNA提取
　　弓形虫RH株速殖子复苏后，每只0.3m1腹腔接种感染昆明小鼠，3～5d后，脱颈处死小鼠，腹腔注入2m1　PBS，收集腹水，PBS洗涤两次，离心收集虫体，加100mmo1/1Tris-C1，5 mmo1/1EDTA，200 mmo1/1 NaC1，1％SDS，100mg/1蛋白酶K，55℃震荡过夜，然后分别用饱和酚、氯仿／异戊醇各抽提一次，等体积异丙醇沉淀，沉淀溶于100μ1三蒸水中，-20℃保存备用。
　　1．2．3　目的基因片段的PCR扩增
　　在0.2m1 Eppendoff管中依次加入下列成份：ddH2O 36.75μ1 10x缓冲液5μ1、dNTP(10mmo1/1)1μ1、正反向引物(20μmo1/1)各1μ1、模版DNA 5μ1，Taq酶0.25μ1，总反应体积为50μ1.95℃预热10min后，94℃60s，50℃60s，72℃ 120s，行30个循环，将PCR产物5tx1在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中电泳，UVP观察结果并拍照。
　　1．2．4　DNA序列测定
　　PCR产物由上海英骏生物技术公司进行序列测定。并与GenBank中的基因序列(S76248)进行同源性比对。
　　1．2．5　克隆序列的生物信息学分析方法
　　利用ExPASy中的Trans1ate程序将jAC1基因的核苷酸序列翻译成蛋白质氨基酸序列，通过protparam(https://us.省略/egi-bin/protparam)分析SAG1蛋白的物化参数，采用NCBI服务器中的CDD程序对氨基酸序列进行保守功能域分析，判断该基因是否具有完整的保守结构域，进一步推断对应的核苷酸序列是否具有完整的开放读码框，采用InterPro程序(.uk/InterProSean)对SWISS-PROT数据库进行检索，寻找氨基酸序列的功能结构域，了解目的序列可能的功能性质，利用NPS及Singa1 IP3.0及PSORT服务器，对蛋白质的二级结构及折叠类型、信号肽位置、亚细胞定位及跨膜螺旋域进行预测，进一步了解目的序列的基本特征。
　　
　　2 结果
　　
　　2．1 目的基因扩增
　　从弓形虫RH株基因组DNA中特异扩增出编码SAG1表面抗原基因片段，PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，
　　　
　　2．2　SAG1基因序列测定
　　以PCR扩增的特异引物，从正反两个方向进行测序，双向测序的结果相吻合，与GenBank中所给的基因序列(S76248)相比对，所扩增序列位于sAC1基因组DNA序列的311～1321处，共1006个碱基，包含了SAC1基因开放读码框内的所有碱基，扩增序列的第519位发生了G-A突 变，但并不影响其编码的氨基酸序列，ACG及ACA编码的均为苏氨酸。
　　　　
　　2．3　克隆序列的生物信息学分析结果
　　2．3．1　54C1基因的氨基酸序列
　　利用ExPASy中的Trans1ate程序将SAG1基因的核苷酸序列翻译成蛋白质氨基酸序列，可知其编码336个氨基酸，结果如下：
　　
　　2．3．2　物理化学特性分析
　　通过protparam(https://us.省略/cgi-bin/protparam)分析SAG1蛋白的物化参数，分析结果表明，34C1分子质量为83495.2，理论等电点为5.04，在哺乳动物、大肠杆菌、酵母中的半衰期分别为4.4h(体外)、＞20h(体内)、＞10h(体内)，不稳定指数为46.93，脂溶性指数为24.73，两亲性指数为0.82。
　　2．3．3　保守结构域搜索
　　利用NCBI的CDD程序对SAG1的保守结构域进行搜索，结果显示SAG1有两个保守结构域，分别位于其氨基酸序列的54～176位及184～300位，这两个保守结构域在介导弓形虫对宿主细胞的粘附以及引发宿主免疫反应的过程中起到了重要作用。
　　2．3．4　氨基酸功能域搜索
　　采用InterPro程序对SWISS-PR07蛋白质数 据库进行检索，对SAG3的氨基酸功能域进行预测，对搜索结果进行分析总结，推测SAG3的氨基酸功能域可能位于54～176位与184～301位之间。
　　2．3．5　二级结构和折叠类型预测结果
　　NPS同源比对发现SAG1二级结构主要由α-螺旋，β-折叠和不规则卷曲组成，其中α-螺旋占18.75％，β-折叠占27.71％，无规则卷曲占59.71％。
　　2．3．6　信号肽预测
　　利用Singa1 IP3.0及PSOR了.jp/form.htm1服务器对SAG1进行信号肽预测，结果显示其编码的氨基酸序列的前47个氨基酸为信号肽序列。
　　2．3．7　蛋白跨膜螺旋及亚细胞定位预测
　　应用PSORT Prediction对SAG1进行跨膜螺旋及亚细胞定位预测，发现其跨膜域位于第320～336位，为典型的Ia型跨膜蛋白，为GPI锚定蛋白，存在于细胞膜上的可能性为91％，在溶酶体膜上存在的可能性为20％，在内质网膜和腔内存在的可能性各为10％。
　　
　　3　讨论
　　
　　自Burg JL对弓形虫sA C1的全部基因序列发表后，国内外一些学者对弓形虫几个分离株进行PCR克隆、测序、表达，国内的陈晓光等曾试过在不同的表达系统中表达SAG1，包括在大肠杆菌中的非融合的pBV220系统和融合的pRSE了系统以及杆状病毒系统，龚娅等以及陈晓光等分别构建了弓形虫重组质粒pET-SAC1，使SAC1在PET系统中表达，朱翔等构建了PGEX-SAC1重组质粒，使其在PGEX系统中表达，我们从弓形虫RH株的基因组中成功的克隆扩增出了SAC1基因序列，经测序证明，仅第519位发生了G-A突变，且为无意突变，并利用ExPASy中的Trans1ate程序将SAC1基因的核苷酸序列翻译成蛋白质氨基酸序列后，利用生物信息学软件分析得出其具有一定的疏水性，具有信号肽序列，信号肽剪切位点约位于第47位，为GPI锚定蛋白，跨膜域位于320～336位，为典型的Ia型跨膜蛋白，与国外学者实验鉴定结果相符合。
　　弓形虫之所以能够广泛的入侵多种宿主细胞得益于分泌于其虫体表的多种表面蛋白，SAC1是弓形虫速殖子期分泌的主要表膜蛋白，研究发现弓形虫的多种表面蛋白中至少有20种与SAC1结构相关，它们被称为SAC1相关蛋白超家族(SAG1-re1ated sequence)，通过对SAC1基因结构与功能的研究，将有利于发现整个SAG1相关超家族的功能。
　　
　　作者简介：陈莎丽(1983―)，女，山西人，硕士研究生，主要从事寄生虫分子生物学研究；江钢锋(1958―)，男，广东人，广东药学院教授，通讯作者，主要从事寄生虫分子生物学方向的研究；汪琦(1970―)，女，安徽人，广东药学院副教授，博士，通讯作者，主要从事寄生虫分子生物学方向的研究。