[浸种催芽对打破云南红豆杉种子休眠的初步研究]红豆杉种子怎么催芽

　　摘要：以云南红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌ．Ｋ．Ｆｕ）种子为研究对象，将种子浸种催芽处理后在基本培养基上培养，探索能有效解除种胚休眠时间过长的途径。结果显示，云南红豆杉种子具有内生菌；离体培养条件下种子较易形成愈伤组织，表明种子有足够的内源激素；尽管各浸种方法均不能有效打破种子休眠、促进萌发，但发现细胞分裂素有促进愈伤组织形成的作用，赤霉素处理比清水处理的萌发率略高，这说明单一激素处理不能有效地解除种子休眠，可进一步做激素之间的交互作用以及对激素应答方面的研究。
　　关键词：云南红豆杉；种子；浸种催芽；离体培养
　　中图分类号：Ｓ５６７．１＋９；Ｑ９４９．６６＋１；Ｓ５０４．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）10－2057-03
　　
　　Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｅｅｄ Ｄｏｒｍａｎｃｙ Breaking Effect of Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｏａｋｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ on Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ
　　
　　ＹＡＮＧ Ｌｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｈｕ－ｇｅｎｇ，ＮＩＵ Ｚｕ－ｌｉｎ，ＳＨＩ Ｗｅｎ－ｙａ
　　（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｏｉｎ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｅ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌ．Ｋ．Ｆｕ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｓｅｅｄ ｄｏｒｍａｎｃｙ ｂｙ ｓｏａｋｉｎｇ ｓｅｅｄｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｓｏｍｅ eｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｔ． ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ； ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｅｅｄｓ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｃａｌｌｕｓ ｅａｓｉｌｙ which ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ were ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ． Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ ｈａｄ ａ ｌｉｔｔｌｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ effect on ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｔｈｏｕｇｈ no soaking ｍｅｔｈｏｄｓ ｃｏｕｌｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｄｏｒｍａｎｃｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ； ａｎｄ gｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ ｈａｄ ｓｌｉｇｈｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ increasing ｔｈｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｅｄｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ single treatmeat of any ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｃｏｕｌｄnot ｒｅｌｅａｓｅ ｔｈｅ ｄｏｒｍａｎｃｙ ｏｆ Ｔ． ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ ｓｅｅｄｓ effectively； ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｆｉｎｄ ｏｕｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ.
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌ．Ｋ．Ｆｕ； ｓｅｅｄ； ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｏａｋｉｎｇ； ｉｎ ｖｉｔｒｏ
　　
　　云南红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌ．Ｋ．Ｆｕ）为国家一级保护植物，不仅是珍贵的用材树种，而且其枝叶、树皮中含有紫杉醇（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）等抗癌活性物质，是国产红豆杉中紫杉醇等抗癌活性物质含量较高的树种，具有很高的药用开发价值［１］。对抗癌药物紫杉醇的开发引发了对该种植物天然资源的掠夺性破坏，为保护红豆杉这一珍贵物种资源，保证紫杉醇的充足稳定均衡供应，应积极培育云南红豆杉人工林资源。利用种子繁育发展人工林是一条最直接的途径，云南红豆杉的实生苗具有根系发达、主干直立、不偏冠、生物量大、抗逆性强等优点，适宜于大规模山地种植。但由于云南红豆杉种子的休眠期较长，在自然条件下需要两冬一夏才能萌发，大量的种子在漫长的休眠期内往往会丧失生命力，从而限制了对该资源的利用［２］。如何解除种子休眠、缩短育苗周期、提高种子繁殖能力，成为云南红豆杉种苗培育中亟待解决的问题。
　　自２０世纪７０年代以来，研究人员相继展开了对欧洲红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ Ｌ．）、杂种红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｍｅｄｉａ Ｒｅｈｄ．）、短叶红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ Ｎｕｔｔ．）等的胚离体培养研究，但试验结果非常有限。１９９１年，Ｆｌｏｒｅｓ等［３］报道，从杂种红豆杉、短叶红豆杉绿色种子中剥取的未成熟胚接种在Ｗｈｉｔｅ或ＭＳ培养基上，其萌发率最高可达７０％，而且种子越成熟，其培养胚的萌发率越低。１９９４年，Ｚｈｉｒｉ等［４］报道了一种简便的方法，可以打破欧洲红豆杉某一栽培品种种子的休眠，使其离体胚快速萌发。１９９８年，梅兴国等［５］采用Ｂ５与ＭＳ相结合的ＢＭ培养基以及适宜浓度的激素，解除了南方红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ．ｍａｉｒｅｉ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｌ．Ｋ）离体胚的休眠，使其胚萌发率达到了８１％，后将培养物转入成苗培养基上，形成了健壮完整的种苗。Ｆｌｏｒｅｓ等［３］在Ｗｈｉｔｅ培养基上培养短叶红豆杉离体胚时，发现胚萌发率随着成熟度的增加而显著降低，而Ｃｈｅｅ在Ｂ５培养基上培养短叶红豆杉离体胚的结果正好相反［６］，这可能是成熟胚与未成熟胚各自适宜的培养基不同所导致的。对云南红豆杉离体胚培养方面仅有赵沛基等［７］做过的一些试验，但成苗率较低，离实际应用还有很长的距离。试验以云南红豆杉种子为研究对象，通过不同种子浸种催芽方法，摸索能有效解除胚休眠时间长的途径；并且在离体培养中应用不同培养基和培养方法诱导胚的萌发，现将结果报告如下。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　试验所用云南红豆杉种子采自云南省楚雄州一平浪林场，采取假种皮已变红的种子，去除肉质假种皮，晾干后带回实验室，与湿沙混拌，保存于４℃冰箱中，随用随取。
　　１．２试验方法
　　１．２．１处理和浸种将种子用洗衣粉在自来水下充分清洗后，对种皮分别采用两种方式处理。一是对种皮不处理；二是剥去坚硬的外种皮和中种皮。然后分别用以下处理方法进行浸种，并且都为室温过夜，每处理的每一个浓度都为３次重复。①温水浸种，将种子放入４５ ℃温水中不停搅拌至室温，继续浸泡；②赤霉素溶液浸种，溶液浓度分别为５０、１００、３００ ｍｇ／Ｌ；③细胞分裂素（６－ＢＡ）溶液浸种，溶液浓度分别为１、２、３ ｍｇ／Ｌ；④清水浸种（对照）。
　　１．２．２消毒与接种将处理好的种子（仁）用０．１％升汞溶液表面消毒并充分清洗后，接种到培养基上，均匀摆放。培养基有ＭＳ和Ｂ５两种，３次重复，置于２５℃±２℃下培养，先暗培养１个月，然后转移到光照条件下每天光照１０ ｈ，光强１ ５００ ｌｘ。继代为每个月一次，将培养物转移至新鲜的培养基上，继续培养。种子萌发指长出胚轴和胚根，幼苗指完整长出子叶、胚轴和胚根的小苗。萌发率=萌发数 / 接种数×100%，出愈率=愈伤产生数/接种数×100%。
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　　２．１种皮对种子培养的影响
　　种皮处理对云南红豆杉种子培养的影响结果见表１，从表１可见，接种时，如果带上种皮，则操作容易，但同时污染率极高；有的培养物甚至在培养３周后才开始出现污染。如果去除种皮（连同内种皮），尽管会增加操作难度，但取得了良好的控制污染效果。而且在相同的培养时间内，去除种皮的种仁在外观上均有变化，有些胚乳有愈伤组织产生，有些胚开始萌动；但保留种皮的种子则没有变化，具体见图１。从这些现象可初步推测，在云南红豆杉的各层种皮间可能存在着内生菌；同时也说明，种皮的存在抑制了种子的萌动。
　　２．２浸种方法对萌发率的影响
　　浸种方法对云南红豆杉种子离体培养萌发率的影响结果见表２，从表２可见，温水浸种、６－ＢＡ溶液浸种不能起到打破休眠和促进萌发的作用，但经６－ＢＡ溶液处理后的种子在愈伤组织产生的数量上要多一些，这说明在云南红豆杉种子离体培养时，细胞分裂素促进细胞分裂的作用明显大于打破休眠的作用。赤霉素溶液处理后的萌发率稍高于对照，但两者差异仍不明显，而且不同的浓度间表现出萌发率没有规律性的变化，这说明３００ ｍｇ／Ｌ浓度以下的赤霉素不能有效地打破云南红豆杉种子的休眠状态。
　　另外在试验中，除了种子正常萌发外，还发现多数种子的胚乳愈伤化，胚乳膨大并裂开，有的裂开处可见增大的胚，具体见图２。但使用的培养基中均未人为添加植物激素，这说明种子本身含有足够的内源激素。膨大后露出胚的培养物，随着培养时间的延长，其胚轴和胚根并未继续伸长，而是也出现了愈伤组织；当培养时间延长到２～３个月后，愈伤组织的颜色发生变化，由白色或浅黄色变红色或紫色，最终为褐色，多次继代后愈伤组织的颜色也越来越深，个中原因可能与云南红豆杉种子中存在抑制物质有关。
　　２．３不同培养基对萌发率的影响
　　在ＭＳ和Ｂ５两种培养基上，云南红豆杉种子（仁）的萌发情况见表３，显而易见，在ＭＳ和Ｂ５两种培养基上的种子萌发率差异不明显。而且观察发现到一个有规律的现象，如果胚乳膨大并开裂的，则其中的胚均不能正常生长成为幼苗，而是随着培养时间的延长，整个外植体都愈伤化；但如果种仁增大而未开裂，在其一端伸出胚根的，则能长出幼苗（图３）。不过幼苗在ＭＳ和Ｂ５培养基上却不能继续生长发育，随着培养时间的延长，胚乳干枯后，幼苗逐渐褐化，最终变褐死亡（图４）。
　　３小结与讨论
　　１）试验表明，云南红豆杉种子中存在着内生菌，在带种皮无菌培养时杂菌大量生长，使种子不能萌发。有研究显示，云南红豆杉的根、茎、叶等部位都有内生菌生存［８］；云南红豆杉种子通过层积处理后［９，１０］，种子萌发效果良好，但对于层积过程中到底是由于什么样的变化导致这一结果，却并未有人做深入的研究来解释。是由于种子内对细胞有毒害作用的物质（如紫杉烷类二萜化合物［１１］）基本消除了，还是激素平衡发生什么变化，这些变化与种子中的内生菌有无关联，等等。因条件有限，试验未能就这一问题进行深入探讨。
　　２）云南红豆杉种子萌发后在培养基上成苗难。试验中尽管也有少量种子萌发后得到了形态正常的幼苗，但似乎无菌的环境却不利于幼苗的继续生长，表现为幼苗在子叶张开、胚乳干枯后、胚根未能继续发育，而后幼苗逐渐褐化，最终变褐死亡。根据前述分析，可进一步推测种皮中的内生菌与云南红豆杉幼苗生长有着密切的关系。
　　３）温水浸种处理对打破种子休眠没有任何作用。细胞分裂素能打破其他物种的种子休眠［１２］，但在本研究中，云南红豆杉种子经细胞分裂素处理后却只能诱导更多的愈伤组织形成，而且具有解除种子休眠和促进萌发作用的赤霉素对云南红豆杉种子的作用也微乎其微。分析其原因，可能是试验采用的是单一激素处理，而在云南红豆杉种子休眠和萌发过程中关于激素间的相互作用以及激素对环境的应答方面目前并没有相关的研究报道，加之云南红豆杉种子本身含有足够的内源激素（这可以从种仁离体培养时极易产生愈伤组织的现象得以证实），是否与外源激素形成颉颃也不得而知。因此，哪种或哪几种激素组合达到什么样的平衡才能打破种子的休眠仍不是很清楚，今后可对此展开系统试验以探索其机理。
　　４）试验得到的云南红豆杉种子萌发率都比较低，这与赵沛基等［７］高达８６％的研究结果不同，分析其原因，一方面是由于试验用云南红豆杉种子为一次性采集种子，然后低温贮藏进行连续的试验研究，或许是保存时间的增加降低了种子的萌发率；另一方面，在云南红豆杉成熟种子中，具有胚发育程度的差异［１３］，这也有可能导致种子出现萌发率低的现象。
　　
　　参考文献：
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　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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