下丘脑神经元 ＳＫＦ－９６３６５对ＳＤ大鼠急性分离下丘脑神经元温度敏感性的影响

　　摘 要：采用电流钳技术观察SD大鼠急性分离下丘脑神经元的自发性放电及其温度敏感特性，显微镜下，急性分离神经元表现为两种形态，一种具有突起，另一种表现为无突起的形态，记录到的有突起的78例神经元中，可以记录到4例热敏神经元(wsn)，但在无突起的61例神经元没有观察到热敏神经元的存在，在浴槽液体中加入SKF96365，这些热敏神经元就会失去温度敏感性，以上结果表明pWSN可能通过突起部位上分布的TRPV4而起到对周围环境温度的感受作用。
　　关键词：热敏神经元：TRP；温度
　　中图分类号：Q42
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2007)01－0025－03
　　
　　在外界环境温度变化时，下丘脑神经元通过调整放电率来维持机体内环境的稳态，根据神经元对外界环境刺激的放电反应将其区分为如体温敏感和不敏感神经元等类型，在温度升高时放电率增加不低于0.8impulse/(s・℃)的神经元称为热敏神经元，但目前对下丘脑神经元的温度敏感机制尚不完全，文献报道在皮肤和外周神经元对温度信号的感受过程中，TRP蛋白都起着关键的作用，温度可以激活TRP通道，出现外向整流的电流成分，但TRP离子通道蛋白是否参与下丘脑视前区和下丘脑前部(POAH)的温度感受功能，目前存在较多的争论，甚至出现针锋相对的争论，Martin M等在研究中证实神经元的纤维联系网上有TRPV4的存在，本文通过观察采用TRPV通道的阻断剂SKF-96365对温度变化时急性分离的下丘脑神经元放电率的影响，试图揭示TRP通道是否参与热敏神经元的温度敏感机制的形成。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 下丘脑脑片制作和神经元急性分离
　　取出生后(17±2)d的SD大鼠，快速断头去脑，分离出下丘脑，迅速置于0℃的高浓度蔗糖液中，用振动切片机 (World Precision InstrumentsMA752)切割成400μm厚的脑片，在HBSS(Sigma)液中漂洗3次后置于95％O2和5％CO2饱和的EBSS(Sigma)液中孵育1h，用针头将脑片分离成小块组织后放入32℃通100％O2的含0.5-1.2g/L细菌蛋白酶XⅣ(Sigma)的HBSS溶液中进行消化，消化时间在10-30min内，酶浓度和消化时间根据出生天数依据分离出神经元的活性进行调整，漂洗后用不同管径的Paster吸管吹打成细胞悬液，静置待细胞贴壁。
　　
　　1.2 电生理记录
　　
　　玻璃微电极拉制后尖端直径为1－2 mm，充满电极内液后阻抗为4－5MΩ，浴槽液成分(mmol/L)为NaCl(125)、HEPES(10)、KCl(2.5)、MgCl2(2)、CaCh2((1)、D-glucose(10)(pH 7.2 with NaOH)，电极液成分(mmol/L)为K-asparate(120)、NaCl(20)、CaCh(2)、EGTA(O.2)、HEPES(10)(pH7.2 with KOH)，记录在20－24℃的室温下进行，实验用CEZ2400膜片钳放大器，当电极尖端与细胞膜之间形成大于1GΩ的高阻密封后，给以负压破膜，使电极内液与细胞内液相通后形成全细胞模式，采用电流钳模式记录静息状态下神经元的自发性放电，电压信号经放大器放大后通过接口与计算机相连，经1kHz滤波，结果分析等均借助计算机用pCLAMP 9.0软件完成，
　　
　　1.3 神经元温度敏感性的分析
　　神经元温度敏感性的观察主要通过TC－202A双向控温浴槽(Harvard Apparatus，美国)来实现，安置在浴槽中的温度反馈装置可以调节温度误差在±0.2范围内，为确保神经元放电的温度依赖性，通常先记录36－37℃下的自发性放电3－5min，然后温度在33－39℃之间改变，每个温度下持续的时间不低于2min，根据文献报道，以神经元的放电率作为纵轴，温度(最小不低于3℃)为横轴绘制曲线，以曲线的回归系数定义神经元的温度敏感性(impulse/(s・℃))，热敏神经元(WSN：Warm-sensitive neurons)的温度敏感性至少高于+0.8impulse/(s・qC).
　　
　　1.4 数据记录和分析
　　数据以表示，数据经SPSS10.0软件包处理分析，统计方法采用ANOVA法，P＜O.05为存在显著性差异。
　　
　　2 实验结果
　　
　　2.1 急性分离的下丘脑神经元与自发性放电的记录
　　在(×40)显微镜下，急性分离下丘脑神经元表现为两种形态，一种由于在分离过程中的机械损伤和／或酶的消化，突起缺失，形态表现为圆或椭圆形状；另一种神经元存在突起，分支多呈现为单极或双极形态，分别记录两类神经元的自发性放电，无突起神经元自发性放电神经元的比率占记录神经元的14.8％(n=61)，有突起神经元则为15.4％(n=78)，x2检验显示二者无明显差别，
　　
　　2.2 SKF-96365对WSN温度敏感性的影响
　　当给存在自发性放电的急性分离下丘脑神经元施加不同温度(33－39℃)的时候，神经元的放电频率主要有两种变化，一种神经元放电频率增高，另一种没有明显变化，本文主要观察那些在温度升高时放电频率明显增加、放电率≥+0.8impulse/(s・℃)的神经元，这些神经元被定义为WSN，在我们记录到的61例无突起神经元中，没有观察到WSN的存在，存在自发性放电的神经元的放电率介于0－0.45impulse/(s・℃)之间；而在有突起神经元的78例神经元中，我们观察到4例WSN，当向这些神经元的浴槽液里加入10μmol/L的SKF-96365时，神经元的自发性放电会明显降低，在30－31℃时，放电频率降低7.1％，升高温度至34-39℃，这些神经元的放电频率也不表现为明显加快，放电率介于0-0.23impulse/(s・℃)之间(图1)，这表明SKF96365可以使WSN失去温度敏感性。
　　
　　
　　3 讨论
　　
　　关于短暂感受器电位TRP是否参与中枢神经元温度敏感性的形成机制一直存在较多的争论，但TRP家族中参与温度感受的TRP家族亚型已被证实参与外周的温度信息感受传导，这包括感受≥42℃的TRPV1、感受≥52℃的TRPV2通道、感受接近于33－39℃生理范围的TRPV3通道和能够感受≥27℃的TRPV4通道，但这些感受温度的TRP离子通道是否参与下丘脑的温度敏感机制尚无定论，有实验证实在下丘脑的POAH部位主要存在TRPV4通道，为此本实验在急性分离的基础上通过采用TRP通道阻断剂SKF-96365观察了TRP是否参与大鼠下丘脑神经元温度敏感性的变化。
　　WSN分为初级WSN(pWSN)和次级WSN(sWSN)，pWSN温度敏感性源于其自身具有温度敏感离子通道的特性，因此在温度变化时能够始终保持定义中热敏神经元的特征，这种特征同样在打断突触联系后的游离神经元中存在，因此在我们实验记录到的热敏神经元中，几乎全部都属于pWSN，本文结果显示在存在突起具有自发性放电的78例神经元中，可以记录到4例pWSN，但在无突起的神经元中，记录不到pWSN的存在，这显示了神经元突起对于pWSN特性的重要性。
　　文献报道TRPV4多存在于神经纤维的部位，但在胞体部位较少观察到，这就使我们有理由推测神经元通过突起上分布的TRPV4通道感受环境的温度变化从而影响神经元在温度升高时的放电率，我们的实验通过在浴槽中加入TRPV的通道阻断剂SKF96365，结果表明pWSN失去了温度敏感性，这一结果也表明pWSN可能通过突起部位上分布的TRPV4而起到对周围环境温度的感受作用。
　　
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