[苎麻不同组织总ＲＮＡ的有效分离]苎麻布组织成分

　　摘 要：从植物组织中提取总RNA是进行植物分子生物学某些方面研究的必要前提，通过选用5种不同的试剂，我们找到一种新的RNAplant分离试剂，可以很有效的提取苎麻叶、茎皮、雌花、果的RNA，且质量很好，可以进行cDNA的合成和RT-PCR等下游实验，并对不同试剂提取和多糖、多酚的去除进行了讨论．
　　关键词：苎麻：RNA；提取：
　　中图分类号：Q331
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2007)01.0021.04
　　
　　从植物组织中提取总RNA是进行植物分子生物学某些方面研究的必要前提，如进行Northom杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库，RT-PCR及差示分析等分子生物学实验，都需要高质量的总RNA，目前常用于植物材料RNA提取的方法有胍法、热硼酸法，CTAB法、SDS法等，这些方法对于提取某些植物的总RNA是有效的，但对另外一些植物来说，却并不一定是好的方法，因为不同植物组织的细胞内外成分复杂多变，在使用某些方法提取RNA时会起干扰作用，如LiC1沉淀，或造成RNA的降解、丢失，或得到的RNA样品含杂质较多而干扰以后的分析研究工作，或者根本得不到RNA，原因是某些植物的组成成分和结构特点不同造成的，在结构上，一些植物具有更为坚硬的细胞壁，除了含有蛋白质、多糖等杂质外，同时含有更多的多酚化合物、木质素、纤维等物质，这些因素决定了这些植物组织RNA提取技术上的特殊性，
　　苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)是荨麻目(Urticales)荨麻科(Urticaceae)苎麻属(Bochmeria)的多年生草本植物，起源于中国，苎麻主要以收获纤维为目的来栽培，还可以用来造纸，做饲料，生产工业酒精，以及入药等，苎麻含有大量的多糖，色素，酚类等物质，陈建荣使用Trizol试剂成功提取苎麻幼嫩茎段RNAt，程超华报道了CTAB法提取悬铃叶苎麻花序RNA的方法，但是我们通过大量实验，尝试了几种方法后，发现以上介绍的方法对苎麻组织的RNA提取时不是成本太高就是费时费力，本文使用一种新的RNAplant分离试剂，可以很有效的提取苎麻雌花、果实、叶片、茎皮的总RNA，且质量很好，可以进行mRNA的抽提、cDNA的合成、RT-PCR等下游实验，而且性价比较好，省时省力节约成本。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 植物材料
　　幼嫩的苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaudh)雌花、叶片、果实、茎皮都取自中国农业科学院麻类研究所“国家种质长沙苎麻圃”中地方品种的藤山鸡骨白，在8月上旬-9月中旬取样，每份材料都分装于5mL冻存管后立即放于液氮中，后取出放于零下80℃冰箱储存。
　　
　　1.2 用具的处理与溶液的配制
　　所有用于RNA提取的用具的处理与溶液的配制均按文献[14]要求进行.1)RNAplant抽提液购自天根生物有限公司(DP407-1，TIANGEN)；2)用DEPC处理的5mol/L NaCI；3)用DEPC水配置的75％酒精；4)用DEPC水配置的5mol/LKAc；5)新的无水乙醇；6)新的氯仿；7)新的异丙醇；8)Millipore 0.22 μm一次性过滤头；9)DEPC水；10)一次性注射器。
　　
　　1.3 总RNA提取步骤
　　1)在10 mL无RNase离心管中加入5 mL抽提液，称取苎麻各部分材料各约0.5g，在液氮中迅速充分地研磨成粉末状，收集进10mL离心管中，迅速激烈振荡5min，室温平放5min，
　　2)在4℃10000r/min离心5min．
　　3)取上清到新的10mL无RNase离心管，重复第2)步。
　　4)取上清到一次性注射器，用0.22μm一次性过滤头过滤
　　5)测量过滤所得的上清体积，加入0.2倍体积5mol/L NaCl，混匀
　　6)加入0.6倍体积氯仿，上下颠倒混匀，
　　7)4℃10000r/min离心30min，取上层水相到新的无RNase离心管。
　　8)加入0.9倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。 9)4℃10000r/min离心30min，弃掉上清，注意不要倒出沉淀，加入5～10mL 75％乙醇，
　　10)4℃10000r/min离心5min，小心倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出弃掉。
　　11)加入70μL无RNase水，吹打几次溶解RNA，－70℃保存。
　　
　　1.4 RNA质量分析
　　取4μL RNA溶液用无RNase水稀释100倍后，使用UNICAM Heλios-α型核酸蛋白仪进行A260和A250的测定，以A260计算RNA的浓度(当A260=1时相当于40mg/L的RNA)，以A260/A280的比值评估RNA的纯度。
　　
　　1.5 RNA的琼脂糖电泳检测
　　取5μL所得的RNA，加1μL6×loadingbuffer后于1.2％的琼脂糖胶上电泳，电压为6V/cm，电泳15－20min后，凝胶成像仪照相分析(最好是变性胶)。
　　
　　1.6 RT-PCR分析
　　用Oligo(dT)18为引物在TIANGEN公司的M-MLV Reserse Transcriptase的作用下合成第一链cDNA，对苎麻不同部位材料合成的cDNA利用NCBI公布的苎麻ACTIN基因的mRNA序列，用Primer premier5.0软件设计一对特异引物(P1：5－GCTCCGTFGAACCCTAAG-3’和P2：5’－GCTCCGATFGTGATGATTT-3’)进行PCR实验，理论扩增片段420bp，反应程序是94℃2min；94℃45s，55℃45s，72℃45s(30个循环)；72℃5min结束PCR。
　　
　　2 结果分析
　　
　　2.1 4种苎麻组织RNA的紫外吸收测定结果(见表1)
　　
　　从提取的4个不同组织的紫外吸收值看，利用RNAplant提取的苎麻4个组织得的RNA都达到了分子生物学实验的要求，蛋白和多糖等污染较少，可以进行下游实验，而且对于不同的组织所提的质量和数量略有不同，每克材料以叶片得到的RNA量最多也最好，其次是茎皮，然后才是雌花和果实，这是因为在雌花和果实中多糖和酚的含量大大增加的缘故。
　　
　　2.2 RNA的琼脂糖电泳检测
　　图1是使用RNAplant提取的苎麻叶片、茎皮、雌花和果实的RNA非甲醛变性琼脂糖凝胶电 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 泳结果．从图1可以看出RNA都完整，可见3条主带，相对分子质量较大的为28SrRNA，相对分子质量较小的为18SrRNA，最小的是5.8SrRNA，其余弥散者为wRNA，其中28S条带的亮度与18S条带的亮度之比接近2:1.说明提取的RNA完整性好无降解。
　　
　　
　　2.3 RT-PCR分析
　　使用RNAplant提取的苎麻花、果、叶、茎皮的RNA经过反转录合成cDNA后，利用苎麻ACTIN基因的特异引物进行PCR扩增，可以得到预期大小的片段，说明我们提取的RNA可以很好的合成cDNA及其他基于mRNA的实验(图2)。
　　
　　3 讨论
　　
　　陈建荣、程超华都报道了提取苎麻RNA的方法，但是对于植物组织来说，不同的部位提取方法都有所改变，我们也尝试使用了Invitrogen公司的Plant RNA Isolation Reagent和TRIzol以及天根公司的RNAprep Plant KIT和Omega公司的E.Z.N.A Plant RNA kit试剂来提取苎麻果实和叶片的RNA(见图3)，对于叶片组织除TRIzol外都能提出符合要求的RNA，而苎麻的果实组织的RNA分离比较困难，只有Plant RNA IsolationReagent和RNAplant试剂可以提出，说明这两种试剂对苎麻不同组织的RNA都能有效分离，但是Plant RNA Isolation Reagent的成本是RNAplant的3倍，综合考虑我们选用RNAplant(TIANGEN)。
　　提取植物RNA时，多酚、多糖等次生物质干扰很大，酚可以和RNA不可逆结合而多糖在水中的理化性质与核酸相似，尤其与RNA相似，故不易被除去且多糖可以限制酶反应，本研究对该方法操作过程中的一些不足，作了一些改进．首先在选用植物组织抽提液时，考虑到对以后逆转录和体外翻译等工作的影响，尽可能减少其他试剂的使用，同时本试剂含有β-巯基乙醇可以抑制内源和外源RNAase的活性；其次避免使用Li-Cl选择沉淀RNA的步骤，防止了LiCl的残留对以后工作所造成的不便；第三就是我们在实验中发现在使用化学手段去除多糖的同时在辅助以物理的方法效果更好，虽然5mol/L NaCl可以去除多糖，但是本实验中我们使用了0.22μm的过滤器后可以非常方便的得到质量很高的RNA(如果不使用过滤器那么就应该多抽提几次，必要时要用酚／氯仿／异戊醇抽提，但是RNA的损失也教大，但是使用过滤器后RNA的得率也不高，差不多是100－150μg/g)，另外我们也尝试使用5nol/L KAc和无水乙醇来去除多糖，在加入NaCl之前加入20％的无水乙醇和0.11倍的5mol/L KAc，室温下放置15min后，4℃10000r/min离心30min，即可有效的去除多糖。
　　在RNA提取过程中常常得不到RNA或RNA产量很低，可能有两方面的原因：一是核蛋白与核酸未能有效分离；二是核酸未能充分溶解到提取液中，离心时与杂质一同沉淀丢失，因此，笔者认为这些方法本身并没有问题，关键在于操作手法的改进，根据笔者的经验，在提取苎麻花RNA时，材料在提取液中必须经过强烈的震荡才能提取出RNA。
　　RNA提取方法要求RNA没有降解的同时还应有较高的产量，特别是mRNA不能在提取过程中丢失或降解，这是进行基因克隆之前提，不同植物及植物的不同部位其在自身的结构和组成上各不相同，如有的组织木质化程度高，有的细胞壁较厚，有的含某类物质多，有的易于降解等，因此很难用一种方法来适应所有的植物组织，所以，实验人员不能用一套固定的操作去提取不同物种、不同组织的RNA，而应该在熟悉RNA提取基本原理及要点的情况下，根据实验要求对实验方法进行灵活地改进与组合，每一套方法都有自身的优缺点，只要掌握了它们的要点与基本原理，就可以对其进行有效地改进，适应各种实验要求。
　　
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