多功能生长因子ＰＴＮ与受体相互作用及跨膜信号传导:重组人表皮生长因子凝胶

　　摘 要：PTN家族由两个成员组成，PTN(pleiotrophin)和MK(midkine)，PTN是由136个氨基酸组成的18kD分泌型多功能生长因子，MK与PTN有50％的氨基酸同源性，它们在正常的细胞的生长、分化和迁移过程中起着重要的作用，也在一些病理过程中，如肿瘤和老年性痴呆中扮演着重要角色，最近发现它们与酪氨酪蛋白激酶磷酸酶受体RPTPβ/ζ相互作用，调节底物β－Catenin(连环蛋白)的酪氨酸磷酸化水平，从而加深了对其生物学意义的了解，也为Ptn和Mk异常表达引起的疾病，如肿瘤和老年性痴呆的治疗提供了新的药物作用靶点。
　　关键词：多功能生长因子PTN； MK；信号传导
　　中图分类号：R994
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007－7847(2007)01－0001－09
　　
　　1 PTN、MK的来源和蛋白质结构
　　
　　细胞外信号分子，例如生长因子，细胞因子，激素和细胞外基质蛋白在正常的生长和发育过程和一些病理过程中起着重要的作用，PTN(也叫HB－GAM)和MK是肝素结合生长因子，是这个家族中仅有的两个成员，它们不同于其它的肝素结合生长因子,PTN是一种18kD的肝素蛋白，最早是从牛的子宫纯化而得，对成纤维细胞具有弱的促有丝分裂作用[7]，而且同时发现它是一种从新生大鼠脑中提取能够促进神经细胞轴突生长的因子，现在人、牛、大鼠、小鼠和鸡的PTN、cDNA已经克隆和测序，编码一种168个氨基酸的蛋白质，包括32个氨基酸组成的信号肽，不同种属的Ptn基因高度保守，是目前所知的所有生长因子中最保守的一种基因，Mk是通过筛选胚胎癌细胞中用维甲酸诱导表达的基因，从鸡的基底细胞也纯化到同源蛋白，PTN和MK是富含半胱氨酸和碱性氨基酸的蛋白质，在脊椎动物，所有PTN和MK的10个半胱氨酸是保守的(图1)。
　　
　　这两种蛋白质的氨基酸的同源性约为50％，两种蛋白由两个结构域组成，C末端和N－末端，NMR结构分析显示，这两种蛋白质的三维结构很相似的(图2)。
　　
　　每个结构域由3个反向平行的β-片层组成，两个结构域由一个可变的结构区相连，虽然精确的结构和功能关系还有待阐明，有趣的是编码PTN的N-末端和C-末端cDNA至少可以转化NIH 3T3细胞，而MK只有C-末端有生物活性，例如，神经细胞轴突生长，纤维溶解和神经细胞的迁移功能，PTN和MK中的半胱氨酸残基通过二硫键相连显示这类蛋白质在不同pH、渗透压和有机溶解剂中都是很稳定的，PTN和MK从果蝇到人都存在，因此，推测其C－末端的结构是重要的，值得注意的是斑马鱼PTN的N，末端结构域(Mdk2)和人PTN的N－末端的部分结构域分别对神经发生和人乳腺癌细胞的生长具有优势负调控作用，PTN与肝素具有高亲和力，在细胞外它与肝素分离后被释放到细胞外基质中，通过CD和NMR分析显示肝素可以诱导PTN的构象改变，其与肝素的结合位点也位于β－，片层结构中，在人和鼠MK的C－末端发现两个肝素结合簇，簇I(人MK K79，R81和K102)和簇II(人MK K86 K87和R89),簇I识别硫酸肝素和硫酸软骨素蛋白聚糖，在神经细胞迁移时的相互作用，以及MK和酪氨酸蛋白磷酸酶RPTPβ/ζ的相互作用时起着重要作用。
　　
　　2 Ptn和Mk的基因表达
　　
　　Ptn基因在大鼠和小鼠发育的神经外胚层和中胚层的特殊细胞和特定阶段表达，出生后在脑组织中的表达很快达到高峰，体内的胶质细胞和神经细胞在表达的时间上有所不同，在成年，Ptn在睾丸子宫和一些胶质和神经细胞中持续表达，并且Ptn的表达还受到PDGF的上行调节，Ptn是首先从与PDGF同源的V-sis原癌基因转化的NIH 3T3细胞中发现的，随后从牛的子宫也纯化到，并发现对NIH 3T3和NRK鼠成纤维细胞具有促生长作用，在V-sis转化的细胞中Ptn的高表达与PDGF对Ptn基因的上行调节相一致，Pin基因5-末端的启动子有一对PDGF刺激起上行反应调节的血清反应元件，相反Mk基因的表达不受PDGF刺激的影响，但Mk的表达受到维甲酸的刺激而表达增加，人Mk基因的5-调控区含有一个维甲酸的反应元件和两个WT-1反应元件，维甲酸通过维甲酸反应元件诱导Mk基因的表达，WT-1反应元件中对WT-1起反应，导致Mk的表达降低。
　　在大鼠的脑缺血损伤过程中，Ptn基因表达水平增高，动物实验结果显示，在脑缺血损伤1-3d时内皮细胞，巨噬细胞和星状细胞的Ptn表达增加，缺血损伤7-14d天仍维持高水平的表达，此外，动物实验结果还显示，在创伤愈合过中，Ptn的表达增加，Ptn可能参与创伤愈合过程中的细胞增殖过程。
　　Ptn的基因表达也受到激素的调控，在成年的子宫Ptn的转录受到雌激素的调节，在妊娠期Ptn的表达水平最高，发情期当雌激素水平达到高峰时，Ptn的表达最低，一种来源于前列腺分泌腺的细胞株，当细胞经过二氢睾酮、睾酮和雌激素处理后，再加入特异性的雄性激素抑制剂处理细胞时，Ptn的表达水平则降低，爪蟾中Mk是在原肠胚后期的神经基底表达，从这个阶段到尾芽期，几乎在所有神经组织中都能检测到Mk的表达，例如脑和神经管，应当注意到鼠的早期神经发育期，Ptn和Mk的表达不同，Mk的表达开始在E5.5的整个胚胎外胚层，而Ptn的表达E8.5的神经褶处，在E11.5的神经管中，Mk的表达局限在室区的神经干细胞，而Ptn的表达到室区的背侧，这种Ptn和Mk表达的不同可能影响神经发育的区域特异性，在神经肌肉接头的发育过程中，两种蛋白诱导爪蟾乙酰胆碱受体聚集在神经肌肉接头部位，MK在脊髓的神经细胞而PTN存在于肌肉细胞，两种蛋白都与一种硫酸肝素蛋白聚糖相结合，这种聚糖蛋白在神经肌肉的发育过程中起着重要作用。
　　
　　3 PTN和MK的多功能生物活性
　　
　　已知PTN具有多种功能作用(见图3)。
　　
　　3.1 有丝分裂原作用
　　PTN能促进V-Sis原癌基因转化细胞和牛子宫细胞的DNA合成，对内皮细胞，上皮细胞和成纤维细胞具有有丝分裂原作用，但PTN的有丝分裂原作用已受到挑战，一些研究者用昆虫和细菌表达的重组PTN具有促使轴突生长的作用，但不表现有丝分裂原样作用，这可能是由于在PTN的折叠和加工过程中使其失去刺激细胞增殖的活性，也可能是因为PTN的有丝分裂原作用需要刺激细胞周期后和其它基因表达后使细胞分化到一定阶段后才表现出来，有结果显示PTN的刺激DNA合成也是在PTN作用细胞16h后才表现出来。
　　
　　3.2 促进神经细胞轴突生长和参与神经细胞损坏性疾病过程
　　PTN能够促进不同神经细胞轴突生长，包括 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 培养的胚胎细胞、外周皮质细胞、神经细胞瘤和PCI2细胞，在原代细胞培养中，PTN加入发育中的皮质和脊髓胶质前体细胞也促使轴突生长，结果表明PTN对少突神经胶质细胞的分化特征起着重要作用，在前体细胞加入抗PTN的抗体后，这些细胞的分化过程减缓，显示PTN对这些前体细胞不仅重要而且是必须的，PTN刺激少突神经胶质细胞后，细胞产生一些分化标志物，综上所述，PTN可能参与少突胶质细胞的分化以及加速少突胶质细胞前体细胞向少突胶质细胞的分化过程，在老年性痴呆病人中发现PTN存在于老年性痴呆和Down’s综合症的老年斑中，MK也存在于老年斑和神经纤维角中，PTN和MK可能与一种低密度脂蛋白受体(LRP)相互作用，后者是老年性疾呆发病过程中淀粉样蛋白前体蛋白(APP)apoE和α－2M的主要受体，因此，PTN和MK在老年性痴呆症中可能具有潜在的重要作用。
　　
　　3.3 促血管形形成作用
　　PTN也参与血管形成，用1、3和7d的缺血损伤大鼠试验证实了PTN在缺血损伤中起着重要作用，PTN在损伤皮层新生血管的周围表达，并且仅在血管内皮细胞，活化的巨噬细胞和活化的星状细胞出现，PTN能够促进培养的内皮细胞的增殖和DNA的合成，牛毛细血管内皮细胞在基质胶表面管状结构的形成在缺少PTN的情况下，2－7d管状结构的形成较弱而且不能维持管状结构，在加入外源性PTN后管状结构能够维持7d，这表明PTN在体外和体内都参与血管形成，而且发现PTN的69-136氨基酸残基，存有一个能够促进血管形成的结构域，该结构域不能导致NIH3T3细胞转化，但却能促进SW13细胞在裸鼠体内肿瘤血管的形成，这可能与结构域能促进SW13细胞释放bFGF有关，Mk基因敲除小鼠显示Mk参与血管的再狭窄过程，Mk基因敲除后血管新内膜的形成减少，而且MK还可以促进吸引炎症反应细胞和小平管肌细胞参与血管的形成过程，有试验表明，MK还促进成纤维细胞介导的胶原收缩和诱导小平管肌细胞分泌一些细胞因子，例如IL-8，从而对内皮细胞起作用，这些作用可以改变血管壁的结构和微环境。
　　
　　3.4 参与骨、肾、肺和牙齿的发育过程
　　在胚胎发育过程中，Ptn和Mk在上皮，间质发生作用时表达，牙齿、肺、肾和一些典型的器管就是通过上皮，间质相互作用而形成的，Ptn在输尿管的周围粘膜组织中表达，PTN和GDNF一起，在体外能诱导输尿管长出分支，PTN能刺激鸡肢芽软骨素的形成，Ptn转基因小鼠骨发育异常，将Mk cDNA转染到骨前体细胞能够促进前体细胞分化为软骨细胞，Ptn和Mk能够诱导成骨细胞的迁移，Mk在胚胎和肺发育的假腺阶段表达，在小管和束状阶段(从E15.5到出生)阶段降低，MK能刺激移植出的胚胎肺的发育，重要的是Mk在出生后发育阶段短暂的表达增加，在出生后，糖皮质激素和维甲酸调节出生后的发育，而MK在出生后能够被维甲酸上调，抗MK的抗体，体外能抑制肾单位和移出的牙胚发育的形成，这表明Mk也参与肾和牙齿的发育过程，实验还表明，MK可能还参与间质肾炎的病理发生过程。
　　
　　4 PTN和MK与癌
　　
　　癌症的发生过程是一系列的分子事件的作用引发的，包括基因突变，例如ras和p53基因突变，生长因子和受体的过度表达，突变后的细胞能够恶性增长和易转移，并对药物产生抗药性．激活的PTN，可能还通过某种信号转导途径使肿瘤细胞更恶性增长，因为发现在多种肿瘤中，Ptn和Mk都是高表达的，Mk在肿瘤组织中的表达比Ptn更广泛，但Ptn在神经细胞瘤、神经胶质瘤、卵巢癌、前列腺癌、Wilms瘤、绒癌和黑色素瘤中高表达，在上述这些肿瘤组织中内源性的Ptn基因持续活化，而在相应的非瘤组织中很难检测到Ptn的表达而Mk在食管癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、直肠癌、肺癌、Wilms瘤中高表达，两者在乳腺癌细胞都处于高表达状态，Ptn在神经细胞瘤的早期高表达，Mk在神经细胞瘤各个阶段都高表达，PTN和MK能够促进细胞迁移的功能可能与肿瘤的转移有关，在神经母细胞瘤中PTN和它的受体RPTPβ/ζ都表达增加，它们的表达水平与该肿瘤恶性程度有关，更直接的证据来源于将Ptn转入NIH3T3细胞和Ptn基因的优势负调控结构域转入NIH3T3细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞中，Ptn能促使NIH3T3细胞转化为恶性细胞，而Ptn的优势负调控区则能减少MDA-MB-231细胞软琼脂和裸鼠体内的克隆和肿瘤形成，并显示PTN(1-40氨基酸残基)做为负调控结构域可以用抑制肿瘤的生长，具有潜在的应用前景。
　　PTN和MK能提高牛内皮细胞内的尿激酶(PA)的活性，并且是剂量和时间依赖性的，PA具有纤维溶解活性，另外，也发现PTN和MK也可以通过下调尿激酶抑制剂(PAI)的水平而增加溶解纤维的活性，由于Mk和Ptn在多种肿瘤组织中特异性高表达，它们可与P53基因突变一样做为肿瘤的标记物，不同的是MK和PTN是分泌型的，在血液中可能容易检测到，而且发现100％的胃癌癌旁组织有Ptn mRNA表达，PTN蛋白在癌组织中的表达明显高于癌旁组织，有远处转移明显高于没有转移的病侧，这表明PTN蛋白表达与胃癌侵袭性生长有一定关系。
　　有趣的是，幽门螺旋杆菌分泌的外毒素VacA能与PTN的受体RPTPβ/ζ结合，而导致胃溃疡，而幽门螺旋杆菌被认为是诱发胃癌的病因之一。
　　
　　5 PTN通过酪氨酸蛋白磷酸酶受体RPTPβ/ζ介导膜信号传导
　　
　　PTN和MK为多功能分泌型生长因子需要与细胞膜表面的受体相互作用，通过信息传递实现其多功能生物学功能，自从PTN发现以来，虽然发现它与细胞表面的多种蛋白相互作用，但功能上的生物学意义并不清楚。
　　最近，我们发现PTN是酪氨酸蛋白磷酸酶受体(RPTPβ/ζ)的一种功能性配体，这一发现的重要性在于这是迄今为止所有已知的30多种受体酪氨放蛋白磷酸酶家族中发现的第一个异源性功能配体，其重要意义在于我们清楚观察到配体PTN与受体RPTPβ/ζ结合的功能反应，而且能增加受体底物β－Catenin的酪氨酸磷酸化水平，这是首次观察到酪氨酸磷酸酶受体与功能性配体结合后引底物酪氨酸磷酸化水平的改变，而且发现PTN处理细胞后，β－Catenin的酪氨酸磷酸化水平迅速增加，但β－Catenin与E-Cadherin的结合却迅速减少，这些结果说明，PTN与RPTPβ/ζ结合后，能引起受体RPTpβ/ζ的酶活性迅速降低，从而使RPTPβ/ζ对底物及Catenin的脱磷酸化作用降低，这与RPTPα的结晶结构，配体与受体结合区形成的二聚体引起酶活性结构域构象的改变，阻止底物进 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 入RPTP的活性部位的结果一致，PTN和RPTPβ/ζ的相互作用，则为RPTPS的结构模型提供了最好的体内实验证据，RPTPβ/ζ基因敲除小鼠的研究发现，RPTPβ/ζ在实验性自动免疫脑脊髓炎和多种硬化症的恢复过程中起着关键性的作用，试验还发现它参与神经损伤的修复和轴突生长的作用，这与PTN的功能表现相一致，实验结果还显示。PTN处理U373MG能使E-Cadherin和β－Catenin的结合减少，因为细胞与细胞之间的粘连取决于E-Cadherin与Catenin家族成员的结合，E-Cadherin的聚集是通过其相连的α、β和γ-Catenin与细胞骨架肌动蛋白相连，这种复合体的形成对于E-Cadherin调节细胞的粘附作用以及把E-Cadherin与连接到其它膜本体蛋白(integral membrane protein)起着关键作用，PTN刺激细胞后将减弱细胞间的粘连作用，从而有利于细胞的迁移和肿瘤细胞的转移，由于β－Catenin在细胞间的连接细胞骨架结构和正常细化转化方面起着重要作用，因此，PTN对β－Catenin酪氨酸磷酸化的调节作用具有重要的潜在生物学意义，Ptn在转化细胞中的持续表达使细胞之间失去接触抑制作用，并引起细胞骨架结构的破坏，有利恶性肿瘤细胞的生长和转移，由于在结肠癌中已发现了Ptn的高表达和β－Catenin高水平的酪氨酸磷酸化，因此，PTN信号转导与Wnt/Wingless和APC－/－结肠癌信号联系在一起。
　　此外，还发现Adducin-2β和GIT－1/Cat－1作为RPTPβ/ζ的底物，PTN刺激细胞后，Ad－ducin-2β的酪氨酸和713，726磷酸化水平增加而且Adducin-2β在PTN刺激30min后，Adducin-2β的蛋白水平迅速降低，Adducin-2β的结合不稳定，从而导致细胞骨架不稳定，细胞骨架的不稳定使肿瘤的恶性程度增加，并且使肿瘤更具侵袭性，用底物诱捕结合酵母二次杂交技术，发现RPTPβ/ζ也可以与GITI相结合，而且PTN可以调节GITI/Cat－1的酪氨酸磷酸化水平，GITI/Cat-1是一种G蛋白偶联受体激酶反应蛋白，使得PTN-RPTPβ/ζ-G蛋白信号传递联系在一起，其交互作用及生物学意义有待进一步的阐明，对PTN-RPTPβ/ζ信号转导途径的研究已应用于神经母细胞的治疗策略中，PTN和RPTPβ/ζ胞外区已成为癌症治疗的新靶点，PTN的核酶和MK的反义RNA以及RPTPβ/ζ胞外区的单克隆抗体和PTN和RPTPβ/ζ胞外的优势负调控结构域也成为癌症治疗的分子靶点，现已将其应用于临床实验，这将为癌症治疗提供了一种新方法，最近，通过应用针对PTN特异的SiRNA，表明沉默Ptn基因可抑制PTEN基因缺失细胞的增殖，并在裸鼠体内证实沉默PTN可使PTEN/MEF241细胞在裸鼠成瘤率被显著抑制，因此针对PTN及受体可能成为一种新型的肿瘤治疗药物，另外血液中MK和PTN可作为肿瘤检测和判断预后的标记物，为监控肿瘤的发展和评价治疗效果提供有用的信息。
　　
　　6 结语
　　
　　PTN和MK是一族参与细胞的生长、分化、发育、损伤修复和多种病理过程(肿瘤，老年性症呆和肾炎)的多功能生长因子，它们的表达水平和活性受到严格的调控，当它们的调控失调时，可以参与一些疾病的发生和发展，随着我们对PTN和MK与受体及底物信号转导途径的深入了解，将可为一些疾病的治疗提供新的药物作用靶点，
　　最近，Lu等人研究发现PTN存在以18kD和15kD的两种形式存在，15kD的PTN是由18kD的蛋白质C－末端去掉12个氨基酸产生的，有趣的是这两种形式的PTN分别作用于不同的受体，18kD的PTN结合RPTPβ/ζ，而15 kD的PTN结合anaplastic lymphoma kinase(ALK)，前者介导的信号传导与细胞的迁移有关，后者介导的信号传递与MAP激酶介导的增殖信号传递有关。
　　
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文