Ｈｅｌａ细胞导入ＴＲＩＭ４５基因后的比较蛋白质组学研究|外源基因导入细胞的方法

　　摘　要：为了确定TRIM45基因的功能和作用机理，将其转入Hela细胞，分析细胞内蛋白质表达水平的变化。研究采用双向凝胶电泳的方法分别对转入pCMV-Tag2B空载体和重组质粒pCMV-Tag2B-TRIM45的Hela细胞全蛋白进行分离，利用PDQUEST7．2软件分析，鉴定得到15个差异点，包括8个上调点和7个下调点。为进一步研究TRlM45基因的功能奠定了良好的基础。
　　关键词：Hela细胞系；蛋白质组学；双向凝胶电泳；质谱
　　中图分类号：Q297；Q51
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2006)02-0103-06
　　蛋白质组学是后基因组时代蓬勃发展的技术体系，其特点是采用高通量、高分辨率的蛋白质鉴定技术，全景式的研究在特定条件下的蛋白质表达谱，并由此在蛋白质水平上获得对组织发育、疾病发生、细胞代谢等过程整体而全面的认识。高分辨率的蛋白质双向凝胶电泳(tWO-dimentionalelectrophoresis，2DE)和高灵敏度质谱(Massspec－trometry，MS)技术相结合，是蛋白质水平研究的强有力武器。
　　RBCC／TRIM蛋白参与细胞增殖、细胞分化、个体发育、肿瘤发生、细胞凋亡等多种生理途径，还与多种疾病的发生相关。人TRIM45编码一个新的RBCC／TRIM家族蛋白，本研究小组早期实验发现它可以抑制Elk-1和AP-1蛋白转录活性，提示它可能与肿瘤发生有关。在对TRIM45功能和作用机制不了解的情况下，本文从蛋白质组学方法人手对该基因进行研究。因为Hela细胞为人宫颈癌细胞系，采用此细胞系能更真实反映TRIM45在人体内的功能。我们分别收集获得稳定转染空载体pCMV-Tag2B和重组质粒pCMV-Tag2B-TRIM45的Hela细胞，提取细胞全蛋白，用固相pH梯度SDS－聚丙烯酰胺双向凝胶电泳分离，银染显色，获得重复性和分辨率较好的双向凝胶电泳图谱。运用PDQuest7．2软件分析，选取2倍以上的差异点，胶内酶解后经MALDI-TOF鉴定。鉴定出的蛋白对于了解和解释TRIM45在细胞中的功能和作用机制将很有帮助。
　　
　　1　材料和方法
　　
　　1．1　试剂
　　固相pH梯度干胶条(pH3～10L，180mm×3mm×0．5mm)、载体两性电解质(pH3～10)、IPG缓冲液、覆盖液、过硫酸铵、PMSF、考马斯亮蓝R-350等产品购自Pharmacia公司；丙烯酰胺、N，N＇-亚甲基双(丙烯酰胺)、甘氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、尿素、甘油、CHAPS等为Amresco公司产品；二硫苏糖醇(DTF)、碘乙酰胺、牛血清白蛋白(BSA)为Sigma公司产品；四甲基乙二胺(TEMED)为SERVA公司产品；低相对分子质量标准为上海伯奥生物制品公司；其他试剂为国产分析纯试剂。
　　
　　1．2 材料
　　稳定转染空载体pCMV-Tag2B的Hela细胞6皿(直径10cm)，稳定转染重组质粒pCMV-Tag2B-TRIM45的Hela细胞6皿(直径10cm)，由湖南师范大学生命科学学院心脏发育实验室提供。
　　1．3　细胞总蛋白质的制备
　　培养的Hela细胞用Dehanks溶液洗涤3次，每一培养皿中加入60μL的裂解液(8mol／L的尿素，2mol／L硫脲，65mmol／LDTY，0．5mmol／LPMSF，4％ W／V CHAPS，1％ NP40)，在冰上用细胞刮刮动细胞使裂解液与细胞充分接触，4℃裂解20min，收集裂解液与细胞及其裂解产物的混合物，4℃放置30min，每隔5min轻微震荡一次，12000r／min离心30min，弃沉淀取上清，Brad-ford法测定蛋白含量后，等量(250μg)分装，-80℃保存备用。
　　
　　1．4 固相pH梯度双向凝胶电泳
　　蛋白质(银染蛋白质的上样量250μg)溶液与水化液(8mol尿素，4％CHAPS，18mmol／LDTY，0．5％ IPGbuffer pH3~10，痕量的溴酚蓝)混合至总体积为350μL，12000r／min离心10min，取上清，上样。两个样品同时在20℃自动进行水化和聚焦，总电压时间积为44420V，1h，其中在30V低电压水化14h，然后经过500V，1h，1000V，1h，8000V梯度0．5h，最后稳定在8000V下进行等电聚焦。等电聚焦结束后，将胶条进行两步平衡，第二向采用分离胶浓度为11．5％，浓缩胶浓度为4．8％的不连续SDS-PAGE垂直平板电泳，每块胶板25mA恒流电泳，然后银染显色。采用清华紫光扫描仪成像系统获取图像，利用PDQuest 7．2(Bio-Rad)图像分析软件对图像进行强度校正、点检测、背景消减、匹配等分析。
　　
　　1．5 胶内酶解
　　选取识别为2倍以上的差异蛋白质斑点进行胶内酶解，按Fernandez等和Gharahdaghi等的方法稍做修改来进行。蛋白质点切下后脱色、脱水、干燥后加入5μL1g／L的胰蛋白酶液，4℃放置30min，使胶块完全泡胀，再加入25μL覆盖液(25mmol／L的碳酸氢铵溶液)，37℃保温18h之后加入50μtL萃取液(67％乙腈，0．1％三氟乙酸)37℃保温1h，超声萃取，重复2次，每次15min。合并上清和提取液，浓缩至5μL左右，用Milliproe公司的ZIPTIPTMC18微柱脱盐后与CCA(a-cyano-4-hydroxycinnamic acid)基质液混合，轻微震荡后吸取1μL均匀点样于不锈钢点样板上，自然风干以供分析。
　　
　　1．6 质谱鉴定
　　制备好的样品用美国应用生物系统公司的Voyager-DET”SRT-MALDI-TOF-MS生物质谱－I工作站进行分析。操作模式为反射，延迟提取，正极性，手动控制，加速电压20000V，离子延迟提取时间为100ns，反射电压比为l：12，获取质量范围为1000―3400Da，激光点击数为每图谱50次，数字化起始时间为46．292ns，Binsize为0．5nS，Vertical scale为500mV，Vertical offset为0．5％，Input bandwidth为500 MHz。质谱使用胰蛋白酶自动降解离子峰作为内部标准校正，获得肽质量指纹图。
　　
　　1．7 数据库查询
　　获得的混合物肽片段数据通过因特网在http：//www．expasy．org上搜索SWISS-PROT和TrEMBL的数据库，搜索参数如下：物种为人，输入参考等电点和肽片段质量(由图象分析得到)，等电点误差为±1个pH单位，蛋白质质量误差为±20％，使用单一同位素质量，最大允许的肽质量 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 误差为±50μg／g，肽片段以正离子形式存在，半胱氨酸为脲甲基半胱氨酸(Carbamidomethyl-Cys)，每个肽片段允许有2个不完全裂解位点，半胱氨酸可能以丙酰胺-半胱氨酸的形式存在，最少匹配的肽片段为4，甲硫氨酸以氧化态存在。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1 双向电泳图谱
　　通过2D技术分离得到两组样品的全蛋白质图谱，每组中选取3次重复性好的图谱用PDQuest7．2软件进行匹配分析，发现其中有15个显著性的差异蛋白质点(见图1、表1)。
　　
　　
　　2．2 差异蛋白质点的MALDI-TOF-MS肽质量指纹图谱分析
　　切取平行胶上15个相应的差异蛋白质点，经胶内原位酶解后进行MALDI-TOF-MS肽质量指纹图谱测定，并以酶自动降解峰(m／z＝1993．9772)进行校正。选取3对重复性好的图谱，用PDQuest7．2软件分析，选取2倍以上的差异点进行酶解鉴定，所鉴定到15个差异点见表1。图2为蛋白质点的肽质量指纹图谱。
　　
　　
　　
　　3　讨论
　　
　　为了研究TRIM45基因的功能，本文比较了转入空载体和TRIM45重组载体的Hela细胞的全蛋白双向凝胶电泳图谱，分析鉴定获到了15个与TRIM45基因表达相关的差异蛋白质，以转入空载体的Hela细胞的蛋白图谱为空白对照，得到了8个上调点和7个下调点。
　　上调的蛋白质中，26S蛋白酶的亚基6A(26S protease regulatory subunit 6A)是人红血球中26S蛋白酶的一个组成部分，26S蛋白酶主要参与泛素化蛋白质的ATP依赖性降解，调节亚基6A主要调节26S蛋白酶的ATP依赖性和底物特异性。
　　肾素结合蛋白(renin binding protein)通过和肾素结合，形成一个高分子量的二聚体，抑制肾素的活力。该蛋白只和肾脏内的肾素结合，和肾脏内的酸性蛋白酶以及肾脏外肾素不能结合，说明它在肾脏中有重要的功能。有研究发现肾素结合蛋白在泌素瘤中表达增高，它可能和肿瘤发生有某些关系。肾素结合蛋白还是N-乙酰葡糖胺的表型异构酶，可以催化N-乙酰葡糖胺转化为乙酰甘露糖胺。
　　Ras-related protein Rab-9A和Ras-relatedproteinRab-13都是Ras家族的GTP酶，该家族主要参与内涵体和高尔基体之间的蛋白质转运，在细胞的生长、分化，细胞因子的产生、趋化，以及囊泡运输和胞吞过程中也行使作用。Ras―relatedprotein Rab-9A，具与GTP的结合的能力，可以激活GTP酶的活性，参与小GTP酶介导的信号转导。近来研究发现Ras-related protein Rab-9A是一个血清广谱抗病毒药物作用的新靶标。有研究称Ras-related protein Rab-13在紧密连接的形成中参与细胞极性运输。
　　蛋白磷酸酶(Protein phosphatase)是PP2A相关蛋白的丝氨酸和苏氨酸磷酸化酶，在细胞内起着重要的作用，参与微管的组装、细胞凋亡、TNF肿瘤坏死信号传导通路并激活c-Jun信号途径氮端激酶。该酶还通过调节组蛋白脱乙酰基酶的磷酸化来控制基因的转录。
　　下调的蛋白质中，a-烯醇酶(Alpha-enolase)存于胞浆，在三羧酸循环中催化磷酸烯醇式丙酮酸的代谢，同时还作为缺氧诱导因子10的靶基因。研究表明，它与肺癌、乳腺癌和头颈部肿瘤、消化道肿瘤、神经内分泌肿瘤的发生发展密切相关。更有研究证明a-烯醇酶是一候选的血浆酶原受体，在转移性头颈部肿瘤中表达水平明显高于为转移的肿瘤，提示该酶可激活蛋白酶及选择性的降解基质成分而介导肿瘤的转移。
　　钙网织蛋白3(Calreticulin 3)是内质网腔内的一种钙结合蛋白，参与钙在细胞内的储存以及蛋白质分子的折叠合和错误折叠蛋白的重折叠，也是一种与维生素K依赖性凝血因子相结合的抗栓剂，可以刺激内皮质释放氮氧化物，抑制血栓形成。
　　连接蛋白(link protein)能增强并稳定糖胺聚糖与透明质酸的相互作用，是透明质酸与糖胺聚糖连接所必需的桥梁蛋白。新的研究结果表明，连接蛋白还参与透明质酸和多能聚糖连接的形成。
　　锌指蛋白在生物体内具有重要功能，参与各种生理活动。锌指蛋白138(Zinc finger protein138)含有5个KRAB框和4个C2H2结构域，推测其可能是个转录因子，具有转录抑制活性。研究者根据锌指蛋白138(Zinc finger protein 138)基因所在的位置，预测该蛋白与一些恶性疾病相关，例如威廉姆斯综合症和裂手。
　　胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-likegrowth factor binding protein)与胰岛素样生长因子Ⅰ和Ⅱ结合随血液流动，这种结合会影响胰岛素样生长因子也细胞表面受体的结合以及该因子的寿命。
　　这些蛋白质多数都跟肿瘤发生有关或者相关，它们表达情况的变化提示着TRIM45基因在肿瘤发生重发挥某种作用，它的作用可能要通过上面得到的某些基因实现，或者TRIM45它的作用影响了其他肿瘤相关基因的活性和表达情况。另外，我们得到的上调蛋白中Ras-related proteinRab-9A和Ras-related protein Rab-13都是MEPK信号通路的上游因子，这跟我们前面实验得到的TRIM45基因抑制MEPK信号通路下游转录因子Elk-1和AP-1蛋白转录活性结果相悖，我们可以用细胞的反馈调节来解释，这一点还需要更进一步的实验验证。
　　综上所述，本研究采用蛋白质组学的方法，通过双向凝胶电泳分别对转入pCMV-Tag2B空载体和重组质粒pCMV-Tag2B-TRIM45的Hela细胞全蛋白进行分离、分析，成功鉴定到了15个TRIM45基因相关的蛋白，这些蛋白的鉴定对于确定TRIM45基因的功能和作用机制具有一定指导意义，也为进一步研究TRIM45基因奠定了基础。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文