棉叶片,梨叶片的不同 三种方法提取不同品种梨叶片总RＮA

　　摘要：为筛选出提取梨叶片总ＲＮＡ的最佳方法，以梨极矮化突变体和苹果梨为材料，采用柱式植物ＲＮＡｏｕｔ试剂盒、ＳＤＳ法和改良ＣＴＡＢ法提取其叶片总ＲＮＡ并比较提取效果。结果表明，改良ＣＴＡＢ法能有效抑制酚类物质和多糖对总ＲＮＡ提取的影响，获得纯度高、完整性好的总ＲＮＡ，其２８ Ｓ ｒＲＮＡ条带亮度高于１８ Ｓ ｒＲＮＡ，所提取的ＲＮＡ适合下一步的研究使用。
　　关键词：梨；ＲＮＡ提取；柱式植物ＲＮＡｏｕｔ试剂盒；改良ＣＴＡＢ法；ＳＤＳ法
　　中图分类号：Ｓ６６１．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）15－3204-03
　　
　　Three Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｐｅａｒ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ
　　
　　ＧＯＮＧ Ｙａｎ－ｍｉｎｇ，ＣＡＯ Ｈｏｕ－ｎａｎ，ＺＯＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｗｅｎ，ＪＩＮ Ｃａｎ，ＸＵ Ｘue
　　（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｙａｎbｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｊｉ １３３００２，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｈｏｏｓｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｐｅａｒ ｌｅａｖｅｓ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔs ｏｆ Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡｏｕｔ， ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｐｅａｒ ｄｗａｒｆ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ Ｐｉｎｇｇｕｏｌｉ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ａｓ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ ｇｏｔ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ of ＲＮＡ． Ｔｈｅ ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｎｄ ｏｆ ２８Ｓ ｒＲＮＡ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ １８Ｓ ｒＲＮＡ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｅａｒ； ＲＮＡ extraction； Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡｏｕｔ； ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ
　　根据植物不同种属或组织间各异的生理特性筛选出适宜的ＲＮＡ提取方法，是提取完整性好、纯度高的ＲＮＡ，进而进行基因克隆与表达分析的前提［１］。木本植物的组织和细胞有厚实且坚韧的细胞壁，较多的单宁、酚、醌等次生代谢物质以及蛋白质、多糖等有机大分子［２］。在ＲＮＡ提取过程中，这些物质中有的会与ＲＮＡ不可逆地结合，有的会与ＲＮＡ共同沉淀下来，不仅降低提取效率，而且严重干扰后续的反转录反应、酶切反应和体外扩增［３－５］。因此，快速且高效地沉淀ＲＮＡ、抑制ＲＮＡ酶的活性、去除多糖和其他次生代谢物质，是ＲＮＡ提取的关键［６］。
　　梨极矮化突变体是在延边小香水梨实生后代中偶然发现的实生矮化突变体，其抗寒性强于Ｓ２、ＯＨ×Ｆ５１、ＯＨ×Ｆ６９和ＰＤＲ５４等砧木，且抗病性也较强，是梨属植物中少有的既矮化又具有较强抗性的资源［７］。与苹果梨、小香水、南国梨等品种相比，极矮化种质的叶片较大、叶色浓绿、质地较厚，含有更多的酚类和多糖。针对以上特点，本研究分析比较了柱式植物ＲＮＡｏｕｔ试剂盒、改良ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法提取梨极矮化突变体和苹果梨叶片总ＲＮＡ的效果，以期为多酚多糖植物叶片总ＲＮＡ的提取提供参考。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１实验材料梨极矮化突变体叶片、苹果梨叶片，采自延边大学农学院果树试验场，液氮速冻后
　　－７０ ℃低温冰箱保存。
　　１．１．２试剂柱式植物ＲＮＡｏｕｔ试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司；反转录酶Ｍ－ＭＬＶ（ＲＮａｓｅ Ｈ－）、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８购自宝生物工程（大连）有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）、聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）、β－巯基乙醇（ＢＭＥ）、十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）购自长春市德双科技有限责任公司；其余试剂均为国产分析纯。
　　１．２方法
　　１．２．１叶片总ＲＮＡ的提取及检测采用柱式植物ＲＮＡｏｕｔ试剂盒、改良ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法３种方法提取叶片总ＲＮＡ，取所得产物２ μＬ，经１％琼脂糖凝胶（含ＥＢ ０．５ μｇ／ｍL），１２０ Ｖ恒压电泳１５ ｍｉｎ检测总ＲＮＡ的质量。具体提取方法如下：
　　１）试剂盒法：参照柱式植物ＲＮＡｏｕｔ试剂盒说明书操作。
　　２）ＣＴＡＢ法：参考Ｃｈａｎｇ等［８］的方法并略作改动，具体步骤如下：①取８０ ｍｇ左右样品，在液氮中研磨成粉末后迅速装入１．５ ｍＬ离心管中，加入７００ μＬ ６５ ℃预热的提取缓冲液［１．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，２％ ＣＴＡＢ， ２％ ＰＶＰ，２％～３％ β－巯基乙醇（用前加入）］，涡旋２～３ ｍｉｎ，６５ ℃水浴２０～３０ ｍｉｎ，中途涡旋２～３次；②加入提取缓冲液０．６倍体积的氯仿，涡旋２～３ ｍｉｎ；③４ ℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ；④转移上清液至新的１．５ ｍＬ离心管，加入１／３体积预冷的１０ ｍｏｌ／Ｌ ＬｉＣｌ，混合均匀，－２０ ℃沉淀１ ｈ；⑤重复步骤③，弃上清；⑥７５％乙醇清洗沉淀后，加入５００ μＬ ０．１％的ＤＥＰＣ水溶解沉淀；⑦加入０．８倍体积酚与氯仿（体积比为１∶１）涡旋２ ｍｉｎ，室温静置５ ｍｉｎ；⑧重复步骤③；⑨转移上清至一个新的离心管，并加等体积氯仿抽提１次，上清中加１／１０体积的５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ（ｐＨ ４．８）和２～２．５倍冷无水乙醇，－２０ ℃沉淀１ ｈ；⑩１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃上清，收集ＲＮＡ，７５％乙醇清洗沉淀１～２次，风干，加入２０～３０ μＬ ０．１％的ＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ，－７０ ℃保存备用。
　　３）ＳＤＳ法：参考王壮伟等［９］的方法进行。
　　１．２．２ＲＴ－ＰＣＲ扩增梨Ａｃｔｉｎ基因以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８为反转录引物，１ μｇ改良ＣＴＡＢ法提取的总ＲＮＡ为模板，Ｍ－ＭＬＶ（ＲＮａｓｅ Ｈ－）反转录酶催化合成ｃＤＮＡ第一链，具体操作按反转录酶说明书进行。根据ＧｅｎＢａｎｋ登录的西洋梨Ａｃｔｉｎ基因序列，设计一对特异引物：ＰｂＡＣＴＦ：５’ＴＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＣＡＧＴ
　　ＣＣ３’，ＰｂＡＣＴＲ：５’ＧＣＣＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧ３’。ＰＣＲ反应体系为２５ μＬ，含模板第一链ｃＤＮＡ １ μＬ，上下游引物各１．５ μＬ（１０ μｍｏｌ／Ｌ），ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ １．５ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．２ μＬ（５ Ｕ／μＬ），１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，其余用去离子水补充。ＰＣＲ反应条件为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性４５ ｓ，６０ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃，５ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测。
　　２结果与分析
　　２．１３种方法提取的叶片总ＲＮＡ质量
　　３种方法所提取的苹果梨总ＲＮＡ均有较明显的２８ Ｓ、１８ Ｓ和较弱的５ Ｓ条带出现，而除了改良ＣＴＡＢ法外，其他两种方法均不能提取出高质量的梨极矮化突变体总ＲＮＡ（图１～３）。由图１、图２可以看出采用柱式植物ＲＮＡｏｕｔ试剂盒和ＳＤＳ法提取的梨极矮化突变体ＲＮＡ条带较暗，其中图２－Ａ ４条泳道中仅前两条有ＲＮＡ条带，排除操作因素后，多次实验证明ＳＤＳ法提取效果不稳定；此外这两种方法提取的ＲＮＡ条带虽然较亮，但２８ Ｓ和１８ Ｓ条带亮度基本相同，显示存在降解现象。另外这两种方法均有蛋白质和ＤＮＡ等杂质的残留。
　　从图３可以看出，ＣＴＡＢ法提取的梨极矮化突变体和苹果梨叶片总ＲＮＡ条带均很亮，且２８ Ｓ条带比１８ Ｓ条带亮，没有观察到蛋白质或ＤＮＡ杂质的残留，得到的ＲＮＡ质量较高。但是图３－Ａ中１、２泳道的条带不规则，说明可能有少量多糖存在，而图３－Ｂ中１～４泳道的条带均完整规则，说明ＣＴＡＢ法提取的苹果梨总ＲＮＡ质量比梨极矮化突变体总ＲＮＡ要好，且多次操作稳定性较强。
　　２．２Ａｃｔｉｎ基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果
　　以改良ＣＴＡＢ法提取的ＲＮＡ为模板进行反转录，使用特异引物扩增Ａｃｔｉｎ基因，琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物片段大小约为２５０ ｂｐ，与预期相符（图４）。说明所提取的ＲＮＡ质量较好，可以用于后续研究。
　　３讨论
　　目前，对于木本植物不同种、不同部位ＲＮＡ的提取，研究人员已经总结出许多科学高效的方法［１０－１３］，但是在实际操作过程中，即使相同种属的不同个体，用一套固定的提取方法也不能保证取得同样的效果。梨极矮化突变体与苹果梨相比，叶片厚且叶色更为浓绿，含有更多的糖类和酚类物质，将研磨后的样品加入到提取缓冲液中时，高含量的糖类物质使样品黏稠结块，不能充分与缓冲液接触。而且，在相同的研磨条件下，梨极矮化突变体比苹果梨更容易发生褐变，影响了ＲＮＡ的提取效果。本实验的ＣＴＡＢ法减少了样品用量，以起到充分裂解样品的作用；提高了β－巯基乙醇的用量，β－巯基乙醇作为强还原剂可以打断多酚氧化酶的二硫键使之失活［８］，从而抑制氧化反应，避免褐化；分别采用１０ ｍｏｌ／Ｌ ＬｉＣｌ和５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ两次沉淀去除多糖，效果十分明显。ＣＴＡＢ法提取苹果梨和梨极矮化突变体总ＲＮＡ质量虽然均较好，但在提取稳定性方面，前者明显强于后者，说明此法用于提取高酚高糖植物提取ＲＮＡ，仍需进一步改进。
　　试剂盒法提取的ＲＮＡ，存在降解和杂质污染现象，不利于ＲＮＡ的后续利用；ＳＤＳ法和改良ＣＴＡＢ法相比，虽然避免了高温可能带来的ＲＮＡ降解的风险，而且用时短，步骤简单，但是提取的ＲＮＡ存在杂质污染。两种方法提取的苹果梨ＲＮＡ质量均高于梨极矮化突变体，说明这两种方法对高酚高糖植物ＲＮＡ的提取效果不明显。王壮伟等［９］应用ＳＤＳ／酚法从苹果属组培苗中得到了高质量、完整性好的总ＲＮＡ，但笔者应用该方法并未得到质量合格的梨极矮化突变体ＲＮＡ，可能与不同种属植物的生理特性有关。另外，组培苗的离体生长环境决定了其体内的生长代谢不同于大田植物，这可能是造成ＳＤＳ法在本实验中不能取得良好效果的另一原因。因此，在参考已报道的ＲＮＡ提取方法的前提下根据材料的特性做适当的改良，才会获得预期的总RNA提取效果。
　　参考文献：
　　［１］ 张薇，张庆华． 植物组织总ＲＮＡ提取方法的研究进展［Ｊ］． 绿色科技，２０１０（３）：２９－３１．
　　［２］ ＷＩＬＫＩＮＳ Ｔ Ａ，ＳＭＡＲＴ Ｌ Ｂ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ． Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ＲＮＡ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ａｎａｌｙｓｉｓ， ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｍ］． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ，１９９６．２１－４１．
　　［３］ ＫＡＴＴＥＲＭＡＮ Ｆ Ｒ Ｈ， ＳＨＡＴＴＵＣＫ Ｖ Ｉ． Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｔｕｒｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔａｉｎ ｌａｒｇｅ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｔａｎｎｉｎｓ［Ｊ］． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８３，１３（４）：３４７－３５９．
　　［４］ ＷＡＮ Ｃ Ｙ，ＷＩＬＫＩＮＳ Ｔ Ａ． Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｏｔ ｂｏｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｃｏｔｔｏｎ （Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）［Ｊ］． Ａｎａｌ ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９４，２２３（１）：７－１２．
　　［５］ 许平，车代弟，王金刚，等． 观赏山梨叶片总ＲＮＡ的提取及质量分析［Ｊ］． 东北农业大学学报，２００８，３９（３）：３４－３８．
　　［６］ 裴东，谷瑞升．几种提取木本植物中ＲＮＡ方法的比较和改进［Ｊ］． 植物生理学通讯，２００２，３８（４）：３６２－３６５．
　　［７］ 朴永虎． 延边小香水梨（Ｐｙｒｕｓ ｕｓｓｕｒｉｅｎｓｉｓ Ｍａｘｉｍ）偶然实生矮化突变体的评价研究［Ｄ］． 延吉：延边大学，２００９．
　　［８］ ＣＨＡＮＧ Ｓ，ＰＵＲＹＥＡＲ Ｊ，ＣＡＩＲＮＥＹ Ｊ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇＲＮＡ ｆｒｏｍ ｐｉｎｅ ｔｒｅｅｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，１９９３，１１（２）：１１３－１１６．
　　［９］ 王壮伟，渠慎春，章镇，等． 苹果属ＲＮＡ高效快速提取新方法［Ｊ］． 果树学报，２００４，２１（４）：３８５－３８７．
　　［１０］ ＭＡＬＮＯＹ Ｍ，ＲＥＹＮＯＩＲＤ Ｊ Ｐ，ＭＯＵＲＧＵＥＳ Ｆ，ｅｔ ａl．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｐｅａｒ ｌｅａｖｅｓ［Ｊ］． ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，２００１，１９（１）：６９－７４．
　　［１１］ 孙长悦． 梨组织ＲＮＡ提取方法研究［Ｊ］． 北方园艺，２００９（３）： １９－２１．
　　［１２］ 赵巍巍，宗成文，曹后男，等．葡萄花序总ＲＮＡ提取方法研究［Ｊ］． 安徽农业科学，２００９，３７（３２）：１６１６１－１６１６２．
　　［１３］ 刘晓菊，洪海波，李敏，等． 改良ＣＴＡＢ法提取核桃总ＲＮＡ试验［Ｊ］． 山东农业科学，２００８（１）：９７－９９．