大丽轮枝菌拮抗细菌多粘芽孢杆菌7-4菌株的筛选与鉴定|大丽轮枝菌

　　摘要：为筛选对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）具有拮抗作用的芽孢细菌，采用改良的琼脂平板扩散法，通过初筛从各地的土样中分离到８４株拮抗细菌菌株，再对其进行复筛，得到１株具有较强抑菌活性的拮抗细菌７－４菌株，并对该菌株进行了形态特征观察和生理生化鉴定，初步判断其为多粘芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）。
　　关键词：大丽轮枝菌；拮抗细菌；筛选；鉴定；多粘芽孢杆菌
　　中图分类号：Ｓ４７６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1797-03
　　
　　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｔｒａｉｎ ７－４ ａｇａｉｎｓｔ
　　Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ
　　
　　ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｙｉｎｇａ，ＭＥＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｓｈｅｎｇａ，ＬＥＩ Ｂａｉ－ｓｈｉｂ
　　（ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ；ｂ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１， Ｈｅｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｇａｉｎｓｔ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ， ８４ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｏｉｌ in ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ areas ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｅｄ by ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｇａｒ ｐｌａｔｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｖｉａ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ， ａ ｓｔｒａｉｎ ｃａｌｌｅｄ ７－４ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ． According to ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ characters， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，the strain 7-4 ｗａｓ preliminarily ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ； ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ
　　棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ．）引起的一种真菌性病害，此病原菌首先于１９１４年在美国的弗吉尼亚州被发现，随后蔓延到世界上其他的产棉国，１９３５年传入中国［１］。目前，棉花黄萎病已经蔓延到全国各产棉区，并造成严重的经济损失，防治难度较大，至今尚无特效的防治药剂，已成为棉花生产的主要障碍之一。现阶段只能依靠以种植抗病品种为主的综合防治措施，但由于高抗黄萎病的棉花品种少，且对大丽轮枝菌致病的机理以及棉花抗黄萎病的遗传方式了解还比较少。因此，在目前缺乏有效抗源的情况下，生物防治将是一种重要的辅助防治手段［２］。而获得高效拮抗菌是生物防治的基础。产芽孢菌是自然界广泛存在的一类细菌，其中一部分可以产生抗菌肽、大环脂、环脂等十几种抗菌物质，从而起到抑制或防治作物病害的作用［３－６］。
　　本试验从不同来源的土样中筛选大丽轮枝菌的拮抗芽孢细菌，以期获得具有较好生物防治潜力的拮抗菌株并对其进行生理生化鉴定。
　　１材料和方法
　　１．１供试病原菌
　　大丽轮枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ．）Ｖ－１９０菌株，由河北农业大学生物制药实验室保存。
　　１．２培养基
　　ＮＡ培养基、ＮＢ培养基、马铃薯培养基（ＰＤＡ）成分及制备参见文献［７］，生理生化鉴定培养基制备及试剂参照文献［８］。
　　１．３试验方法
　　１．３．１土样采集从邢台、保定、唐山、邯郸、沧州等地的棉田中取１０～１５ ｃｍ深处土样，风干后，保存于牛皮纸袋中。记录采样时间、地点等信息。
　　１．３．２土壤中芽孢细菌的分离纯化取土样１．０ ｇ研细，加入装有９．０ ｍＬ无菌水的试管中摇匀，８０ ℃水浴３０ ｍｉｎ，然后取１．０ ｍＬ进行１０倍梯度稀释至１０－６，分别取１０－４、１０－５、１０－６ ３个梯度的稀释液０．１ ｍＬ涂布在ＮＡ培养基平板上，３７ ℃倒置培养２４ ｈ。挑取形态、大小、色泽不同的单菌落分别转接至ＮＡ斜面上，并分别进行菌株编号，３７ ℃培养２４ ｈ，置于４ ℃冰箱保存备用［９］。同时采用平板划线法检测每株菌的纯度。
　　１．３．３大丽轮枝菌混菌平板的制备向培养１０ ｄ左右的大丽轮枝菌斜面加５．０ ｍＬ无菌水，用接种环轻轻刮取斜面上的孢子，摇匀，形成孢子悬液。再将孢子悬液加入融化后冷却到５０ ℃左右的ＰＤＡ培养基中，迅速摇匀，倒平板，凝固待用。
　　１．３．４大丽轮枝菌拮抗细菌的初筛取制备好的大丽轮枝菌混菌平板，用接种环从分离到的细菌斜面上挑取少许菌体点种在ＰＤＡ平板上，２４℃培养３ ｄ，挑选出有抑菌圈的拮抗菌株备用。
　　１．３．５大丽轮枝菌拮抗细菌的复筛将初筛获得的拮抗细菌活化后接种于装有５０ ｍＬ ＮＢ培养基的２５０ ｍＬ三角瓶中，于３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床上振荡培养４８ ｈ。
　　在制备大丽轮枝菌混菌平板时，向培养基中加入终浓度为０．２５ μｇ／ｍＬ链霉素，放冷后，用打孔器打出一定数量均匀的孔，分别向每孔中加入７０ μＬ培养４８ ｈ的拮抗细菌发酵液上清，静置３０ ｍｉｎ，２４ ℃培养３ ｄ。测量抑菌圈直径，挑选出抑菌圈大且清晰的菌株［１０］作为目的菌株，用于后续试验。
　　１．３．６菌株的形态特征观察采用稀释涂平板法将适当浓度的目的菌株菌悬液涂布在ＮＡ平板上，静置３０ ｍｉｎ，３７ ℃倒置培养２４ ｈ，观察菌落形态特征。
　　从３７ ℃培养２４ ｈ的斜面上挑取少量目的菌株的菌体进行革兰氏染色和芽孢染色，染色方法参见文献［８］，显微镜下观察其菌体和芽孢形态。
　　１．３．７菌株的生理生化鉴定根据《常见细菌鉴定手册》［８］及《伯杰细菌鉴定手册》［１１］中相应属、种鉴定有关的内容，选取了以下生理生化试验对目的菌株进行鉴定：Ｖ．Ｐ试验、酪素水解试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、淀粉水解试验、过氧化氢酶试验、硫化氢产生试验、糖发酵试验、柠檬酸盐试验、甲基红试验、耐盐试验、酪氨酸水解试验。
　　２结果与分析
　　２．１拮抗细菌的初筛结果
　　从土样中共分离得到４００余个菌株，经初筛获得８４株拮抗菌株，其中有１８株产生的抑菌圈直径较大、抑菌能力较好（表１）。
　　２．２拮抗细菌的复筛结果
　　将初筛获得的拮抗能力较好的１８株菌株进行复筛，其中４株拮抗菌株（４－５９、７－４、８－５４、１２－２３）的发酵液上清液表现拮抗活性。对复筛得到的４株拮抗细菌所分泌的拮抗物质进行抗菌活性的比较，结果发现７－４菌株的无菌拮抗物质溶液对大丽轮枝菌表现的拮抗活性最高（表２，图１）。
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　　７－４拮抗菌株在ＮＡ平板上单菌落呈圆形，边缘整齐，不透明，乳白色，表面微有皱褶，不光滑，呈馒头状（图２）。
　　２．４７－４菌株的菌体特征
　　７－４菌株细胞经染色后在显微镜下观察呈杆状，革兰氏染色呈阳性，菌体大小为０．７～０．８ μｍ×２．０～３．０ μｍ；可形成内生芽孢，芽孢囊明显膨胀，芽孢椭圆形、中生到次端生、稍膨大（图３）。
　　２．５７－４菌株的生理生化鉴定结果
　　７－４菌株的生理生化鉴定结果见表３。结合７－４菌株的形态特征和生理生化特征综合考察，根据《伯杰细菌鉴定手册》［１１］初步判断其为多粘芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）。
　　３讨论
　　试验中某些初筛活性很高的菌株进入复筛后，其抑菌活性明显降低，甚至消失，这可能是由于抑菌机制不同（比如营养竞争与分泌抗菌素），或者是培养条件不合适所导致的，如果换用其他培养基或优化培养基配方，应该还可以获得抑菌效果不错的菌株。事实也证明当适当改变培养基配方时，以前抑菌活性较弱的菌株其抑菌活性有明显提高，这也表明发酵条件对拮抗物质的产生具有重要影响。
　　本试验复筛是采用摇瓶发酵，再用其发酵液上清进行抑菌活性检测，因此本试验复筛获得的４株拮抗细菌产生的抑菌物质可以认为是胞外产物，而且产生的抑菌圈在室温放置一个月后，抑菌圈中仍无病原菌长出，说明其性质比较稳定。其后对其进行了鉴定，发现这些抑菌物质均为蛋白（或多肽），因此在后续的研究中，可以进行发酵条件的优化、拮抗多肽的分离纯化、蛋白多肽的基因克隆等。
　　生物防治作为棉花黄萎病最有前景的防治方法之一，在防治棉花黄萎病，最大限度地降低该病害造成的损失，提高棉花生产的经济效益和社会效益方面具有重大意义。芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，由于其抗逆性强，抗菌谱广泛，对多种病原真菌、细菌均有较强的抑制作用，而引起研究者的广泛关注。目前，生防研究所涉及的芽孢杆菌种类主要有枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、多粘芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、蜡状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等［１２－１５］。因此，本试验主要是针对产芽孢细菌进行筛选，这样便于菌剂商品的保存，也可以使试验成果更便捷地在农业生产中应用。
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