[受精卵反义寡核苷酸显微注射影响因素的研究]反义寡核苷酸

　　摘 要：以金鱼受精卵为材料，通过胚胎培养探讨反义寡核苷酸显微注射剂量、受精卵质量、胰酶消化浓度等对受精卵反义寡核苷酸显微注射的影响，研究表明，反义寡核苷酸注射剂量在4.6nL、胰酶消化浓度在0.4％的情况下，选用质量较好的受精卵注射，显微注射效果较好，可为之后的基因功能研究提供材料保障，利用显微注射法导入反义寡核苷酸来研究基因的功能，是研究基因功能的有效途径。
　　关键词：金鱼；反义寡核苷酸技术；显微注射；胚胎培养
　　中图分类号：0954.4　文献标识码A　文章编号：1007-7847(2007)04-0234-04
　　
　　反义寡核苷酸技术(Antisense olizonuclcoti-des，ASON)是用一段人工合成的能与RNA或DNA互补结合的寡核苷酸链抑制基因的表达，其原理通过阻抑从DNA至mRNA的转录过程或从mRNA到蛋白质的翻译过程，而阻断细胞中的蛋白质合成，反义寡核苷酸技术具有高特异性、无毒性等特有的优点，近年来在抗病毒、抗肿瘤、细胞凋亡、信号传导及在遗传育种、胚胎发育的研究中有愈来愈广泛的应用，将反义核酸导人体内是反义核酸技术中的重要环节，目前主要方法有：直接微注射、血管壁外聚合药物转运系统、气囊导管定位腔内转移、改良电穿孔法等，因金鱼体外受精体外发育，且个体产卵数量大，胚胎透明，用显微注射法将反义寡核苷酸(ATc，SCON)直接注入受精卵，可在活体上观察金鱼器官发育，因此该研究方法在研究鱼类胚胎发育调控机制有突出的优越性，本实验室在前期研究工作中发现，Vsxl基因是与金鱼眼睛空间模式形成相关的调控基因和分析二倍体依赖型机制的候选目标基因，为了研究候选目标基因Vsxl在金鱼发育过程的具体功能及对其下游基因的调控机制，我们采用反义寡核苷酸技术和显微注射的方法，将反义寡核苷酸(ATG，SCON)直接注入金鱼的受精卵，使Vsxl的mRNA不能翻译成相应的蛋白质，以此探究Vsxl在金鱼胚胎发育过程中的功能及其调控方式，显微注射反义寡核苷酸是该项研究的前提条件，本文探讨了影响金鱼受精卵反义寡核苷酸显微注射的客观因素，为提高反义寡核苷酸显微注射成功率提供依据。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1．1　材料
　　1．1．1　试剂
　　注射用硫酸链霉素(100万单位)，注射用青霉素钠(80万单位)均为华北制药股份有限公司产品；氯化钠、氯化钙、氯化钾、碳酸氢钠、胰蛋白酶等为国产分析纯试剂；优质石蜡油；灭菌ddH2O；过滤了的曝气水；过滤了的加了抗生素的隔夜冷开水。
　　配制5倍浓度的Half’s液(即高渗液)，10倍浓度的Haft’s液；10倍浓度的Half’s液配方：35g NaCI，1g CaCl2，0.5g KCl溶于1L ddH2O中，烧开后冷却通气，临用前加NaHCO，配成0.2g/L；将青霉素80万单位溶于2mL ddH2O中，取25uL溶解好的青霉素至1L Half’s中，将链霉素100万单位溶于2.5mL ddH20中，取125μL溶解好的链霉素至1L Half’s中。
　　1．1．2　仪器设备
　　XTB-01型体视镜购自中国光学仪器厂；NANOLl7ER2000显微注射系统购自美国WPI公司；注射用的毛细管为WPI公司的Replacement3.5 inch glass capillary(300)；拉针仪为美国Sutter公司生产的P97 Puller；Pr0600ES型显微照相图象采集系统购自日本Nikon公司；Viewfinder3.0成像软件购自日本Olympus公司。
　　
　　1．1．3　注射用反义寡核苷酸
　　显微注射用反义寡核苷酸morpholino oligosATG，SCON为Gene Tools公司合成，ATG为与金鱼Vsxl基因的mRNA序列中1～24碱基序列互补的一段序列；SCON为standard control即标准对照，为一段人类特有的还未发现与之互补的一段序列，注射前将300mmol/L的morpholinooligos溶于300μL灭菌水配成浓度为1nmol/lmorpholino oligos，分装保存于-70℃冰箱中备用。
　　1．1．4　实验动物
　　“红帽子”品系金鱼幼苗(Carassius auratus)购自长沙市花鸟市场，于金鱼饲养场饲养至成熟。
　　
　　1．2　实验方法
　　1．2．1　受精卵的制备
　　将红帽雄性金鱼的精液挤入装有少量曝气水的培养皿中，同时挤入同品系的雌性金鱼卵子，使之受精，得到自交二倍体受精卵，每次控制受精卵数目约200个。
　　1．2．2　金鱼受精卵的显微注射
　　1．2．2．1　受精卵去膜
　　受精卵受精后静置3～5min，用胰酶去膜，约20min，期间观察吸掉未受精的卵子，剥膜后，将受精卵转入装有曝气水的培养皿中洗2～3次，洗去黏附的胰酶，吸20个左右受精卵放人10倍高渗液中，然后转入盛有5倍高渗液的小皿中准备注射。
　　1．2．2．2　显微注射
　　将注射针调至约30°～45°，将受精卵逐个注射ATG，或者注射灭菌水和SCON，注射时迅速刺人受精卵动物极，注入试剂时有鼓动，图1为显微注射示意图。
　　1．2．3　注射受精卵的培养
　　注射好的受精卵，移入有琼脂底板的培养皿中培养，培养液是加入青霉素和链霉素的隔夜冷开水，次日可只用过滤了的曝气水培养，培养期间，在体视镜下观察，再次挑出未受精的卵子和由于注射机械损伤导致破碎的胚胎，每隔3h换一次培养水，并不断观察已注射胚胎和未注射胚胎的发育状况。
　　1．2．4　注射受精卵的统计
　　当金鱼胚胎发育到原肠早期时剔除发育不下去的胚胎或死亡的胚胎，或注射ATG未起到抑制作用而发育正常的胚胎，分别统计计数。
　　
　　2　结果与分析
　　
　　2．1　受精卵质量对胚胎发育的影响
　　受精卵的质量主要由精子和卵子的质量决定，与产卵时间和受精温度相关，我们观察到早上和上午产的卵子质量较下午好，在体视镜下可以观察到上午受精卵均匀透亮，下午的卵子可见少许颗粒，分布不是很均匀，经过显微注射的受精卵这种差异尤其明显，不同质量的受精卵显微注射的结果见表1，在观察统计2006年近半个月时间的注射情况(从4月2号至4月18日)，在其它条件一致的情况下，9:20～10:20的受精卵质量较17:00以后的受精卵好，经注射灭菌水后培养结果更可看出，上午受精卵注射后死亡率为13.9％，显著低于下午受精卵注射后的死亡率41.0％(Z=-16.131，P=0.000)，这主要是金鱼产卵的最佳温度约20℃，而金鱼在3月底至4月 底大概有一个月的产卵期，不过到每天下午或金鱼产卵后期，可能因气温相对较高，卵子质量差，注射的受精卵死亡率高，因此应选择上午的受精卵做注射实验，并使温度控制在20℃左右。
　　　　
　　2．2　去膜胰酶浓度对胚胎发育的影响
　　在其它条件一致的情况下，通过比较不同浓度的去膜效果，发现浓度为0。4％的胰酶比较合适，大约15min可以去膜；浓度低于0.4％的胰酶消化受精卵的膜较困难，需要半小时甚至更久才能去膜，影响单细胞期及时注射，另外，消化时间过久，也会导致胚胎消化过度，卵透明带蓬松，活力下降，降低注射后卵的成活率，而浓度高于0.4％的胰酶容易消化过度，胚胎细胞呈不规则形，影响受精卵的发育。
　　
　　2．3　注射剂量对胚胎发育的影响
　　如表2所示，随着注射剂量的增加，在原肠早期，注射了ATG的胚胎不能继续发育的比例和注射了灭菌H20和SCON的胚胎的死亡率基本呈增加的趋势，但注射4.6nmol/L、6.9nmol/L、9.2nmol/L两两比较P＞0，05，无显著差异，因此注射的体积不必过大，注射ATG在4.6～9.2 nmol/L都有较明显的抑制效果，从图2中可看出大部分胚胎不能继续发育，注射4.6nL ATG的胚胎有70.6％的高比率不能继续发育，这可能是由于ATG的作用导致Vsxl表达受阻，已达较好的注射效果；注射灭菌H2O和SCON的胚胎死亡率显著低于注射ATG(P＜0.05)，说明注射的机械损伤和毒性作用相对比较小，因此，实验在保证注射效果的前提下，尽量选择低剂量，以减少毒性作用，本实验选择注射的最佳剂量为4.6nL。
　　　　
　　2．4　注射技术的影响
　　显微注射的影响因素除动物的种属、受精卵的质量、注射基因浓度、剂量外，还包括技能的熟练与否等其它因素，注射针的质量也是显微注射成败的关键之一，若太粗，针头碰触受精卵易滚动，不好准确刺人，且受精卵受伤较大；若太细，易堵塞针孔，理想的注射针针尖开口应小于1μm，尖部长度适宜(50～80μm)，注射时，使注射针停留2～3。后迅速抽出注射针，可保证注射物全部注入且不回流，若即刻抽出注射针易带出注射物或胞质，影响注射效果，注射的时期和部位也是影响注射效果的因素之一，梁利群等认为外源基因导入受精卵的最佳时期应选在单细胞后期，因鱼的受精卵发育较快，本实验显微注射时间在单细胞期至二细胞期，注射部位为动物极，另外，我们还观察到，注射前将去膜受精卵放人10倍浓度的Half’s液中约30s，可使细胞膜张力增大，注射后膜破少，卵子萎缩，以便注射，再转入加有5倍浓度的Half’s液的小皿中注射，便于伤口愈合，愈合后，不流细胞质。
　　　　　
　　3　结论
　　
　　受精卵的质量好坏是影响显微注射存活率的重要因素之一，同一条雌性金鱼的卵子的质量也会随着产卵时间的推迟，或是环境温度的变化有所改变，一般早上和上午的卵子较下午和晚上的好，以20℃为基准，温度大约20℃的卵子较25℃以上的卵子质量好，因此，在早上和上午选择质量较好的受精卵，用0.4％的胰酶去膜，注射剂量为4.6nL，熟练的显微注射技能，可提高受精卵反义寡核苷酸显微注射的成功率，为基因功能研究提供材料保障，利用显微注射法导人外源基因或者反义DNA是研究基因功能的有效途径，以上结果可为显微注射法的应用提供有益的借鉴。
　　
　　作者简介：喻小燕(1973―)，女，湖南宁乡人，湖南信息职业技术学院讲师，湖南师范大学生命科学院硕士研究生，主要从事蛋白质化学与蛋白质组学研究；梁宋平(1946―)，男，湖南安化人，湖南师范大学教授，博士生导师，通讯作者，主要从事蜘蛛毒素与蛋白质组学研究。