人－山羊异种核移植胚胎发育的初步研究 异种鱼换核

　　摘 要：以体外分离培养的人胚胎成纤维细胞为核供体，经血清饥饿培养后，通过显微操作技术移入山羊去核卵母细胞中，采用化学方法激活重组胚。通过体外培养观察，2-细胞胚胎发育率可达51．33％，4-细胞发育率为31．42％，但发育至桑椹胚阶段的胚胎数目大大减少，仅为9．73％。虽然目前尚未能获得异种核移植囊胚，但实验结果说明山羊成熟卯母细胞可以支持人体细胞核完成重编程， 人-山羊异种体细胞核移植重组胚可在体外完成其早期发育。
　　关键词：异种核移植；人：山羊；卵母细胞
　　中图分类号：Q813；R329
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007―7847(2006)01―0050―05
　　治疗性克隆(Therapeutic ccloning)是指以患者 的体细胞作为供核，移入去核的卵母细胞内，将重 构胚培育至囊胚，从内细胞团中分离出胚胎干细 胞，为患者提供与其自身遗传物质一致的组织细 胞或器官，用于患者疾病的治疗。目前，治疗性 克隆存在的问题主要有：核移植总体效率很低、卵 母细胞来源及质量不稳定、供核细胞种类的选择、 操作水平、体外培养条件等。由于人类卵母细胞来 源非常有限，且受到法律、伦理等多种因素的限 制，很难获得足够数量的人卵母细胞用于实验研 究，异种核移植技术的出现为解决这一难题提供 了可能，目前已建立了使用兔卵母细胞的异种体 细胞核移植胚胎干细胞，但胚胎发育率较低。本 研究旨在对山羊成熟卵母细胞能否支持人体细胞 核的重编程，并使重组胚获得一定程度的发育进 行初步探索，以便为将来利用动物卵母细胞来获 取治疗性克隆所需的胚胎干细胞奠定基础。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1．1 材料
　　1．1．1 胚胎组织
　　胎龄5-9周人工终止妊娠的废弃胚胎，要求 胚体完整，无严重污染，废弃胚胎由解放军第四 军医大学唐都医院妇产科提供．使用前征得患者 同意，签署知情同意书，并获得学校医学伦理委员 会的批准。
　　
　　1．1．2 山羊卵巢
　　采集于陕西省西安市屠宰场．采集的卵巢置 于20-30℃含0.32g／L硫酸庆大霉素的生理盐 水中，6~8 h运回实验室。
　　
　　1．1.3 主要试剂
　　DMEM培养液、M199培养液、SOF培养液、胎 牛血清(FBS)购自GIBCO公司；二甲基亚砜 (DMSO)、离子霉素(10nomycin)、6－二甲氨基嘌呤 (6-DMAP)、Hoechst33342、细胞松弛素B(CCB)、 透明质酸酶、胰蛋白酶、EDTA、聚乙烯吡咯酮 (PVP)、矿物油购自Sigma公司；磷酸缓冲液 (PBS)自配。
　　
　　1．1，4 仪器设备
　　细胞培养箱(Heraus，西德)、实体显微镜 (Olympus)、显微操作仪(Nikon)，
　　
　　1.2 方法
　　1，2，l 山羊卵母细胞的体外成熟
　　将卵巢系膜剪去，用温生理盐水冲洗后置于 含10mg／L肝素的PBS液中，用切剖法采集卵斤 卵母细胞复合体(cumlllus-oocyte complexes， COCs)，在实体显微镜下检查回收，将收集的 COCs在PBS中清洗3次，再H―M199 (M199+10％FBS+10 mg／L FSH+20 mg／LLH) 洗1次后置于H―M199中进行体外成熟培养，培 养条件为38．5 t、5％CO2、饱和湿度．
　　
　　1.2.2 成熟山羊卵母细胞的去核
　　体外成熟培养18～20 h后，将COCs置于 0．2％透明质酸酶中消化，轻轻吹打，使卵母细胞 周围的卵丘细胞脱落，选择排出第一极体的卵母 细胞在H―M199中清洗3次，置于含5 mg／L CCB 和10％FBS的PBS微滴中，38．5℃、5％C02、饱 和湿度孵育10 rain，在显微操作仪下用持卵针固 定卵母细胞，使第一极体在镜下位于2点至4点钟 的位置，用外径为20～30μm的去核针吸取第一 极体及其周围1／4--1／3的细胞质进行去核。去核 后的卵母细胞用1 mg／L Hoechst33342染色15 rain，然后在荧光显微镜上检查去核情况，挑选出 完全去核的卵母细胞作为核移植受体，见图1。
　　
　　1.2.3 人胚胎成纤维细胞的分离培养
　　用含青链霉素的PBS浸洗胎儿3―5次，实 体显微镜下去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部 组织以PBS冲洗充分除去红细胞后剪碎至I mm3 大小，0．25％胰蛋白酶-0．04％EDTA混合消化 液室温下作用3-5 min，加入等量DMEM+10％ (v／v)FBS培养液终止消化，800~--t 000r／min离 心3-~5 min，弃上清液，加入前述培养液悬浮细 胞，调整细胞密度在105～106／mL，置于37℃、 5％CO2、饱和湿度培养箱中培养30min，等部分 成纤维细胞首先贴壁后，将培养液与未贴壁细胞 一同吸出，加入培养液继续培养。约2～3 d后， 胚胎成纤维细胞约80％铺满瓶底，可进行传代培 养，或冷冻保存备用，见图2。
　　
　　1．2．4 供体细胞的准备
　　取第5―7代对数生长期人胚胎成纤维细胞， 在DMEM+0，5％(v／v)FBS培养液中血清饥饿培 养3～5d。核移植前2h用0．25％胰蛋白酶消 化，制备成单细胞悬液，待用。
　　
　　1．2．5 重组胚的构建
　　将供体细胞悬于含10％PVP和5mg／LCCB 的PBS操作微滴中，在显微操作仪下用内径为 12～15μm的注射针反复吸吐供体细胞，使其细 胞膜破裂成为核胞体，再用注射针将核胞体直接 注射到去核卵母细胞的细胞质内。
　　
　　1．2．6 重组胚的激活及体外培养
　　将注核后的重组胚在H-M199培养液中培养 3―6h后进行激活。用含5μmol／LIonomycin的 培养液处理4min，然后在含2 mmol／L 6-DMAP 和5mg／LCCB的培养液中作用4h，用培养液洗 3次后转移到SOFaa培养液(SOF+2％必需氨 基酸+l％非必需氨基酸+1 mmol／L谷氨酰胺+ 8g／LBSA)微滴中，与颗粒细胞单层在38．5℃、 5％C02、饱和湿度下进行共培养，每48h换液1 次。第72h加10％(v／v)FBS继续培养，每天 观察，记录胚胎发育情况，见图3。
　　
　　2 结果
　　
　　实验结果证明，山羊成熟卵母细胞可以支持 人体细胞核完成重编程，人-山羊异种体细胞核 移植重组胚可在体外完成其早期发育，2-细胞胚 胎的发育率可达51．33％，但发育至桑椹胚阶段 的胚胎数目大大减少，桑椹胚发育率仅为 9，73％，且目前尚未能获得囊胚发育，见表1，
　　
　　3 讨论
　　
　　目前，核移植胚胎干(nucleartransferredem― bryonicstem，ntES)细胞的建系效率还很低，理论上 一个ntES细胞系平均需要666个卵母细胞[5)．如果 使用人卵母细胞进行治疗性克隆，用于人类疾病的 治疗，这样的代价是非常大的。解决这一问题的关 键是用新的策略获得卵母细胞。多数研究证实，某 些哺乳动物(如牛、羊、兔)的卵母细胞具有接受异 种体细胞核的能力，异种体细胞核在这些动物的卵 母细胞中可以发生去分化和重编程。由于羊的 卵母细胞容易获得，而且西北农林大学在体细胞克 隆羊研究方面积累了丰富的研究经验和方法， 因此，我们首次探索用山羊卵母细胞来支持人体 细胞核的发育。
　　在本实验中，我们首次将人胚胎成纤维细胞 核移入山羊卵母细胞，2-细胞胚胎的发育率可达 51．33％，但发育至桑椹胚阶段的胚胎数目大大减 少，桑椹胚发育率仅为9．73％。低胚胎发育率是 哺乳动物异种核移植胚胎发育存在的一个共同问 题，由于影响核移植胚胎发育的因素很多，包括供 核细胞类型、卵母细胞去核的方法、体外培养条件 等，大量的实验证明，以胚胎干细胞和胎儿 成纤维细胞作为核供体比成年体细胞作为核供体 所得异种重组胚的发育率要高。我们在进行人― 山羊异种重组胚的发育实验中选用人胚胎成纤维 细胞作为供体核，也基于此考虑。
　　核质相容性是影响异种核移植胚胎发育的另 一重要因素。当体细胞核移入去核卵母细胞后， 首先在母源性RNA和蛋白质因子的控制下进行 去分化和重编程，只有在母源性RNA和蛋白质消 耗完之前，细胞核能够正确启动某些基因的转录， 并合成相应的蛋白质和酶，胚胎的发育才能进行 下去，否则，发育将停滞。这一过程被称为“母胚 转换”(maternfil to embryonic transition，MET)。能 否正确地进行MET是影响异种重组胚发育的重 要因素，而顺利进行MET取决于异种核质间的亲 和性或排斥性。与山羊同种核移植的囊胚发育率 (17％―20％)相比较，本研究人―山羊异种重 组胚的桑椹胚发育率仅为9．73％，且尚未能获得 异种核移植囊胚，不能排除人―山羊异种间核质 存在排斥性。
　　此外，选择合适的体外培养体系亦是影响重 组胚发育的关键因素。本实验采用的SOFaa培养 基为山羊胚胎体外培养的常用培养基，可以支持 山羊卵胞质的发育，但可能对人―山羊异种核移 植胚胎发育产生不利影响。本实验中囊胚发育率 低与体外培养体系也可能有一定关系。
　　本研究初步探索选用人胚胎成纤维细胞作为 核移植供体细胞，移入去核的山羊成熟卵母细胞 构建重组胚，获得了较高的2―细胞、4―细胞胚胎 发育率(51，33％和31，42％)，提示山羊成熟卵母 细胞可以支持人体细胞核完成重编程，且重组胚 可以在体外完成其早期发育．但桑椹胚发育率较 低(9．73％)，且暂时未能获得异种核移植囊胚，可 能与动物异种重组胚的MET、以及培养基、培养 温度的选择等有关。如何解决这些矛盾，提高重 组胚的发育率，将是今后研究的重点。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文