蜂胶总黄酮含量 [败酱草中总黄酮的提取工艺优化及含量动态变化]

　　摘要：以败酱草为原料，分析提取时间、料液比、提取温度、乙醇体积分数等因素对败酱草总黄酮含量的影响，以Ｌ９（３４）正交试验方法优化总黄酮的提取工艺，然后在该工艺条件下考察了不同部位、不同采摘时期败酱草中总黄酮含量的动态变化，同时也对超声波在提取败酱草中总黄酮的效果进行了探索。结果表明，提取时间、料液比、提取温度、乙醇体积分数对败酱草总黄酮含量均有影响；败酱草中总黄酮提取的最佳工艺组合为体积分数为5０％的乙醇以１∶２０的料液比在6０℃条件下提取２.0 ｈ；引入超声波技术后，提取总黄酮的含量有所提高；同时发现败酱草嫩叶中总黄酮的含量最高。
　　关键词：败酱草；总黄酮；超声波；含量变化
　　中图分类号：S567.9；Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2301-04
　　
　　Extraction and the Dynamic Content of Total Flavonoids in Patrina
　　
　　ＬＡＮ Ｔａｏ－ｆａｎｇ，ＬＵ Ｊｉａ－ｋｕｎ，ＬＩ Ｘｕｅ－ｆｅｉ，ＬＩＵ Ｘｉｎ－ｊｉａ，ＰＩＡＯ Ｌｉ，ＭＥＮＧ Ｌｉａｎｇ－ｙｕ
　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ ｉｎ Ｂｏｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｚｈｏｕ １２１０１３，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，China）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐａｔｒｉｎａ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； ａｎｄ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｐａｔｒｉｎａ ｄｕｒｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ． Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ， ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｓｏｌｉｄ to ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｌ９（３４） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｒｒａｙ ｄｅｓｉｇｎ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗａｓ ａｌｓｏ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ 5０％ ｅｔｈａｎｏｌ ｗｉｔｈ ａ ｓｏｌｉｄ to ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ １∶２０ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｆｏｒ ２.0 ｈ ａｔ 6０℃． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ａｎｄ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｎ ｔｅｎｄｅｒ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐａｔｒｉｎａ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐａｔｒｉｎａ； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ； content variation
　　
　　败酱草（Ｈｅｒｂａ ｐａｒｔｉｎｉａｅ），又称泽败、苦菜等，属败酱科多年生草本植物。败酱草是我国常用中草药，具有清热解毒之功效，野生败酱草广泛存在于自然界［１，２］，研究表明，败酱草含有较高的黄酮、皂苷等活性物质，败酱草叶粗提物具有明显的抗氧化、抗肿瘤及抗菌等药理功效；研究发现败酱草具有极高的营养价值，含有丰富的维生素、氨基酸和矿物质，在我国的许多地方被作为野生蔬菜食用，由此可见败酱草不仅是一个安全性高的中药材而且还是一较好的天然抗氧化剂［３，４］。大量研究表明，黄酮类化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗过敏、抗炎症等多种生理活性及药理作用，且无毒副作用［５］。黄酮类化合物具有抗氧化的效果，可减少自由基对人体的伤害。目前对败酱草的研究还不够深入，对其中黄酮类化合物的研究也不够丰富，没有使这一中草药的价值得到最大的发挥。因此研究败酱草中的黄酮类化合物具有较大的实际意义。本研究对败酱草中总黄酮的提取条件进行了优化，对不同部位、不同采集时期的败酱草中总黄酮含量进行了测定，旨在确定败酱草中总黄酮的最佳提取工艺条件和最佳采集时期及应用部位，为败酱草的综合开发提供科学依据。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　１．１．１败酱草败酱草老叶购自药店，产地辽宁，败酱嫩叶和根自当地野外采集。
　　１．１．２试剂芦丁标准品，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，无水乙醇、硫酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、苯酚均为分析纯，去离子水。
　　１．１．３仪器双光束紫外可见分光光度计，７２２Ｎ可见分光光度计，高速离心机，１０１Ｂ－２型电热鼓风干燥箱，超声波细胞粉碎机。
　　１．２方法
　　１．２．１芦丁标准曲线的建立精密称取干燥至恒重的芦丁标准品２００ ｍｇ，用７０％乙醇定容到１００ ｍＬ容量瓶中，放冷，精密吸取５．０ ｍＬ，置于５０ ｍＬ容量瓶内，用水稀释至刻度，得０．２ ｍｇ／ｍＬ芦丁标准溶液。精密吸取０、２、４、６、８、１０ ｍＬ芦丁标准溶液至２５ ｍＬ容量瓶中，加３０％的乙醇溶液至１０ ｍＬ，加入５％的亚硝酸钠溶液０．７ ｍＬ，摇匀，静置５ ｍｉｎ，再加入５％的硝酸铝溶液０．７ ｍＬ，摇匀，静置５ ｍｉｎ，加入１ ｍｏｌ／ｍＬ的氢氧化钠溶液５．０ ｍＬ，最后用３０％乙醇溶液定容到刻度线，摇匀，静置５ ｍｉｎ后，在最大吸收峰处测定吸光度。以芦丁标准溶液的浓度（Ｃ）为横坐标，所测吸光度（Ａ）为纵坐标绘制标准曲线，采用线性回归的方法，求回归方程。
　　１．２．２样品处理与败酱草中总黄酮提取败酱草用去离子水洗净后自然阴干，粉碎，过４０目筛，脱脂烘干后，乙醇回流法提取，准确称取４ ｇ败酱草加入一定体积分数的乙醇溶液，浸提黄酮类物质。
　　１．２．３败酱草提取物中总黄酮含量测定［６－９］采用硝酸铝显色法，以芦丁为标样，在５１０ ｎｍ处测定其吸光度，测定总黄酮的含量。吸取提取液０．５ ｍＬ，置于２５ ｍＬ容量瓶内，加入５％的亚硝酸钠０．７ ｍＬ，摇匀后静置５ ｍｉｎ，加入１０％的硝酸铝０．７ ｍＬ，摇匀后静置５ ｍｉｎ，再加入１ ｍｏｌ／ｍＬ的氢氧化钠５ ｍＬ，用３０％的乙醇溶液定容至２５ ｍＬ，静置５ ｍｉｎ后在５１０ ｎｍ处测定其吸光度，参比为不含提取液的空白试剂，根据芦丁标准曲线及回归方程即可知提取液中总黄酮含量。
　　１．２．４单因素试验分别研究乙醇体积分数、提取温度、料液比（Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同）、提取时间对败酱草总黄酮含量的影响。
　　１．２．５正交试验根据单因素试验结果，确定以提取时间、提取温度、料液比、乙醇体积分数为试验因素进行正交试验，因素与水平见表１，优化败酱草中总黄酮的提取工艺。
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　　２．１芦丁标准曲线
　　吸取芦丁标准溶液进行标准曲线绘制，得芦丁标准曲线为＝１０．１４３ ０Ｃ＋０．００５ ６，ｒ＝０．９９９ ２（图１）。
　　２．２单因素试验
　　２．２．１提取时间对败酱草总黄酮提取率的影响在提取温度为７０℃，料液比为１∶２０，乙醇体积分数为６０％的条件下，研究提取时间对败酱草总黄酮提取率的影响（图２）。结果表明，随着提取时间的增加，总黄酮的提取率也逐渐增加，提取２．０ ｈ时达到最大值，然后提取率逐渐下降，因此，选择２．０ ｈ为总黄酮提取的最佳提取时间。
　　２．２．２提取温度对败酱草总黄酮提取率的影响在提取时间为２．０ ｈ，料液比为１∶２０，乙醇体积分数为６０％的条件下，研究提取温度对败酱草总黄酮提取率的影响（图３）。结果表明，在一定温度范围内，总黄酮的提取率随着温度的升高而增加，温度超过７０℃时，总黄酮得率增幅放缓，总黄酮提取时要防止温度过高而引起化合物的分解，因此，最适温度设为６０～８０℃。
　　２．２．３料液比对败酱草总黄酮提取率的影响在提取时间为２．０ ｈ，提取温度为７０℃，乙醇体积分数为６０％的条件下，研究料液比对败酱草总黄酮含量的影响（图４）。结果表明，随着溶剂量的增加，总黄酮含量明显增加，在料液比为１∶２０后趋于稳定，当黄酮类物质完全溶出后，即使继续加大溶剂的量，总黄酮含量基本趋于稳定。综合考虑，最适料液比设为１∶２０。
　　２．２．４乙醇体积分数对败酱草总黄酮提取率的影响在提取时间为２．０ ｈ，提取温度为７０℃，料液比为１∶２０时，研究乙醇体积分数对败酱草总黄酮提取率的影响（图５）。结果表明，在乙醇体积分数小于６０％的乙醇溶液中，总黄酮得率随乙醇体积分数增加而增加，超过６０％后，总黄酮得率随乙醇体积分数的增加为减少，这是由于败酱草黄酮类物质种类很多，不同种类黄酮极性不同，按相似相溶原理，在乙醇体积分数６０％时，溶液极性有利于大多数黄酮类物质溶解。因此，最适乙醇体积分数为６０％。
　　２．３正交试验结果分析
　　采用Ｌ９（３４）正交试验进行败酱草总黄酮提取，确定总黄酮最佳提取条件，试验结果见表２。由表２可知，各因素对总黄酮提取率的影响主次顺序为：Ａ=Ｃ＞Ｂ＞Ｄ。根据正交试验可以确定败酱草中总黄酮最佳提取工艺条件为Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ2即提取时间为２．０ｈ，提取温度为6０℃，料液比为１∶２０，乙醇体积分数为5０％。
　　２．４败酱草不同部位总黄酮含量的比较
　　根据正交试验的结果，在败酱草中总黄酮最佳提取条件下对败酱草嫩叶和根中总黄酮分别进行提取，结果见图６，由图６可以看出，败酱草不同部位总黄酮含量变化规律为：嫩叶＞老叶＞根。
　　２．５超声波对败酱草中总黄酮提取的影响［１０-１２］
　　根据正交试验的结果，使用超声波辅助提取，超声波外接水浴锅保证提取温度，提取时间为３０ ｍｉｎ，后续提取时间缩短３０ ｍｉｎ，以维持总的提取时间不变，然后进行总黄酮含量的测定，结果见图７。测得总黄酮含量分别为：嫩叶２．１３％，根１．６８％，老叶１．８６％。由结果可以看出，超声波破壁有利于总黄酮的提取。
　　３结论
　　试验研究了败酱草中总黄酮的最优提取条件。通过正交试验确定最佳提取条件：提取时间２．０ ｈ，提取温度6０℃，料液比１∶２０，乙醇体积分数5０％。
　　测得总黄酮的含量为老叶１．７５％，嫩叶２．０４％，根１．５９％。可以看出，不同部位或不同采摘时间，败酱草中总黄酮的含量有所差异，其总的变化规律为：嫩叶＞老叶＞根，因此，对败酱草的开发利用，嫩叶的价值更高。
　　引入超声波提取后，则总黄酮含量为老叶１．８６％，嫩叶２．１３％，根１．６８％，不管是那一部位，何时采摘，超声波对提取败酱草中黄酮类物质均有改善。应用超声波进行黄酮类物质的提取，经过３０ｍｉｎ的破壁，总黄酮的提取率有所提高，但提高的幅度不同，由于本研究未对超声波作进一步的研究，而是只用了一种频率、一个超声时间，所以会造成应用超声波的效果不太明显，但起码证明应用超声波这一手段对提取是有好处的，这一点有待于以后进一步研究。
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　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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