黄孢原毛平革菌产木素过氧化物酶发酵条件的优化 黄孢原毛平革菌

　　摘要：对白腐菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）产木素过氧化物酶的发酵条件进行了研究。在单因素试验的基础上用正交试验进行工艺参数的优化。结果表明，木素过氧化物酶的最佳培养条件为培养１３ ｄ、接种０．５ ｍＬ，料液比１∶２．５（Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ）、培养温度２５℃，酶活为７７１ Ｕ／ｍＬ。
　　关键词：白腐菌 Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ；木素过氧化物酶；正交试验
　　中图分类号：Ｑ５５文献标识码： Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2305-03
　　
　　Optimization of Production of Lignin Peroxidase by Phanerochaete chrysosporium
　　
　　ＷＡＮＧ Ｍｉｎ１，２，ＷＡＮＧ Ｊｉｅ２
　　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｎｇｓｈｕｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｅｎｇｓｈｕｉ ０５３０００，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ；
　　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅbｅｉ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｒａｆｔ ｏｆ ｌｉｇｎｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｂｙ ｗｈｉｔｅ－ｒｏｔ ｆｕｇｉ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ， ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ， ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ， １３ｄ； ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ， ０．５ ｍＬ； solid to liquid ratio， 1∶25（W/V，g∶mL）ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ２５℃； ｌｉｐ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ７７１ Ｕ／ｍＬ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｈｉｔｅ－ｒｏｔ ｆｕｇｉ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ； Ｌｉｇｎｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
　　
　　白腐菌是已知的惟一能在纯系培养中有效地将木质素降解为ＣＯ２和Ｈ２Ｏ的一类微生物［１，２］，是迄今为止最有效、最主要的木质素降解微生物，在自然界的碳素循环中起着关键作用［３］。重要的木素降解酶有３种，木素过氧化物酶（Ｌｉｇｎｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＬｉＰ，ＥＣ．１．１１．１．７）、锰过氧化物酶（Ｍａｎｇａｎｅｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＭｎＰ，ＥＣ．１．１１．１．７）和漆酶（Ｌａｃｃａｓｅ，ＥＣ．１．１０．３．２）。ＬｉＰｓ是该酶系的主要成分，在木质素降解中起关键性作用。大多数白腐菌仅产生２种甚至１种分解木质素的酶［４－６］。木素降解酶不仅降解木质素，而且通过催化自由基链式反应，对环境中难降解有机污染物具有高效、广谱的降解功能。故利用白腐菌处理工业废水、生物制浆、土壤修复等是目前生物技术应用研究中的热点课题。对黄孢原毛平革菌分泌胞外酶的条件进行优化，旨在对白腐菌的工业化应用和生物质的高效利用提供一定的理论依据。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　甜高粱秸秆，于２００８年１０月取自河北农业大学标本园，经烘箱干燥后用中药粉碎机粉碎，过４０目筛，备用；黄孢原毛平革菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ），购自中国工业微生物菌种保藏中心；ＰＤＡ培养基： 去皮马铃薯２００ ｇ，加水１ ０００ ｍＬ煮沸３０ ｍｉｎ，滤去马铃薯，滤液补足至１ ０００ ｍＬ，葡萄糖２０ ｇ，琼脂１５ ｇ，１２１℃灭菌１５ ｍｉｎ。主要用于活化菌种；固态发酵培养基：甜高粱秸秆粉２０ ｇ，葡萄糖０．４ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．０６ ｇ，水４０ ｇ，１２１℃灭菌１５ ｍｉｎ。
　　１．２方法
　　１．２．１不同发酵条件对木质素酶活影响的正交试验根据单因素试验，确定最佳水平。进行正交试验，因素与水平设计见表１。
　　１．２．２酶活测定粗酶液的制备：在秸秆发酵过程中，每２ ｄ取出２ ｇ发酵样品，加入缓冲液浸提，３０℃水浴振荡浸提１ ｈ。然后过滤，离心（３ ５００ ｒ／ｍｉｎ，１５ ｍｉｎ）后取上清液用于酶活测定。
　　木素过氧化物酶（ＬｉＰ）活力测定［７］：取０．２ ｍＬ藜芦醇溶液（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ），０．４ ｍＬ酒石酸缓冲液（２５０ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值为３．０）与０．４ ｍＬ粗酶液混匀，即得１ ｍＬ反应液。于３０℃向此反应液中加２０ μＬ Ｈ２Ｏ２溶液（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ）启动酶促反应，并在３１０ ｎｍ波长下测定反应１ ｍｉｎ前后的反应液吸光度变化。一个酶活力单位（Ｕ）定义为每分钟氧化藜芦醇产生１ μｍｏｌ藜芦醛所需的酶量。
　　２结果与分析
　　２．１不同发酵时间对酶活性的影响
　　不同发酵时间对黄孢原毛平革菌产木素酶活的影响见图１。由图１可知，发酵时间为１４ ｄ时，木素过氧化物酶酶活最高，为６７２ Ｕ／ｍＬ。
　　２．２不同碳源对酶活性的影响
　　碳源是构成菌体碳架及能量的来源，真菌细胞干重的１／２是由碳组成。碳源在真菌生长过程中占很重要的地位。白腐菌在降解木素时需要外加碳源，一般为糖类，高碳／低氮有利于木素降解［８］。试验以不同碳源取代基础培养基中的葡萄糖，考察它们对木质素酶合成的影响。在初始培养基中分别采用不同碳源（果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精），测定产酶状况，发现酶活力随不同碳源而异，如图２所示。添加葡萄糖产生木素过氧化物酶的酶活最高，为７２０ Ｕ／ｍＬ，因此确定葡萄糖为木素过氧化物酶最佳碳源。
　　２．３不同氮源对酶活性的影响
　　在初始培养基中分别采用不同氮源（尿素、碳酸氢铵、草酸铵、柠檬酸三铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、氯化铵），考察氮源对酶活的影响。由图３可知，在以硝酸铵为氮源的培养物中木素过氧化物酶酶活最高，为７２２ Ｕ／ｍＬ。
　　２．４不同温度对酶活的影响
　　微生物的增殖受温度的影响较大。由图４可知，在２０、２５、３０℃下，木素过氧化物酶酶活差异较大，以２５℃酶活最高。在此温度下木素过氧化物酶酶活为７２２ Ｕ／ｍＬ。
　　２．５不同接种量对酶活的影响
　　接种量小会使发酵周期延长；接种量大能促进菌体迅速增殖，但会使培养基黏度增大，影响溶氧，衰老细胞增加，发酵后劲不足，发酵产物产量较小。由图５可知，最佳接种量为１．０ ｍＬ，木素过氧化物酶酶活为６９６ Ｕ／ｍＬ。
　　２．６不同料液比对酶活的影响
　　固态发酵基质含水量是影响固态发酵的成功与否的关键。发酵初期，适当的湿度可以促进孢子的萌发和菌丝体的生长，湿度过大一方面会影响培养基的通透性，不利于散热和气体流通；另一方面， 若湿度过大，湿热灭菌时培养基凝结成块，菌丝体只能在团状固体物料的表面生长，不能深入到内部，降低了菌丝体对固体物料的利用率。由图６可知，物料与水分比例为１∶２．５（Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同）时酶活最高，木素过氧化物酶酶活为６９９ Ｕ／ｍＬ。
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　　表２为正交试验结果。由表２可知，影响木素过氧化物酶酶活的主次顺序为Ｄ＞Ｂ＞Ａ＞Ｃ，即培养温度＞接种量＞培养时间＞料液比。最佳发酵条件为Ａ2Ｂ１Ｃ３Ｄ２，即培养时间为１0 ｄ，接种量为０．５ ｍＬ， 料液比为１∶２．５，培养温度为２５℃，在此条件下进行验证试验，重复３次，木素过氧化物酶酶活为７７１ Ｕ／ｍＬ。
　　表３是正交试验的方差分析结果。由表３可知培养时间、接种量、料液比、培养温度４个因素中只有培养温度对木素过氧化物酶酶活的影响显著。
　　３结论
　　白腐菌系好氧菌，培养方式对产酶影响非常明显。在试验中采用振荡培养白腐菌的方式，通过正交试验确定了木素过氧化物酶的最佳培养条件为培养１0 ｄ、接种０．５ ｍＬ、料液比１∶２．５、培养温度２５℃，酶活可达７７１ Ｕ／ｍＬ。
　　白腐菌是一种能降解木质素的真菌，那么利用木质素类农业废弃物如各种作物的秸秆作为培养基进行固体发酵，既满足了白腐菌生长的原始生态环境而有利于其生长，同时又可以对农业废物进行再利用，这样不仅降低了大规模生产漆酶的成本，更重要的是减少了农业污染。
　　参考文献：
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　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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