酶法预处理苎麻叶提取总酚酸的工艺优化_酚氧化酶

　　摘要：为开发和利用苎麻资源，采用酶法对苎麻叶总酚酸的提取工艺进行了研究。用纤维素酶对苎麻叶进行预处理，以单因素试验为基础，对总酚酸提取率进行正交设计，用福林－酚比色法于７５５ ｎｍ波长处测定总酚酸含量。结果表明，酶解时ｐＨ值为５．０，酶解后在料液比为１∶２０（Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ）、温度为7０℃、提取时间为2.0 ｈ、提取２次、乙醇体积分数为７０％条件下，苎麻叶总酚酸的最佳提取率为０．０５０％。影响提取率４个因素主次顺序为提取时间＞料液比＞ｐＨ值＞温度。该工艺提取率高、步骤简单、成本较低，适合于苎麻叶中总酚酸的工业化提取。
　　关键词：苎麻；总酚酸；单因素试验；正交设计
　　中图分类号：S563.1；R284.2文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）10－2105-03
　　
　　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｐｈｅｎｏｌｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｂｏｅｈｍｅｒｉａ ｎｉｖｅａ
　　ｂｙ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ
　　
　　ＬＩＵ Ｚｈａｏ－ｘｉａ，ＺＯＵ Ｋｕｎ，ＺＨＯＵ Ｙｕａｎ，ＬＥＩ Ｘｉａｏ－ｙａｎ
　　（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ／Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，
　　Ｃｈｉｎａ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｃｈａｎｇ ４４３００２， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｍａｋｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｕｓｅ ｏｆ Ｂｏｅｈｍｅｒｉａ ｎｉｖｅａ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ． Ａｆｔｅｒ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｅｎｚｙｍｅ， ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ ｔｏ ｃｈｅｃｋ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ａｔ ７５５ ｎｍ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐＨ ５．０， ｓｏｌｉｄ ｔｏ ７０％ ｅｔｈａｎｏｌ ｒａｔｉｏ １∶２０（Ｗ／Ｖ， ｇ∶ｍＬ）， ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｆｏｒ １ ｈ ａｔ ５０ ℃ ｔｗｉｃｅ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗａｓ ０．０５0％， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ３５．５％ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｎｏｎ－ｅｎｚｙｍｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｏ ｃｏｍｍｏｎ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ＞ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ＞ ｐＨ ＞ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ｂｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ waｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｏｅｈｍｅｒｉａ ｎｉｖｅａ； ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ； ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ
　　
　　苎麻（Ｂｏｅｈｍｅｒｉａ ｎｉｖｅａ Ｌ．）为荨麻科苎麻属多年生宿根性植物，苎麻根、叶药用，在我国１６世纪就有记载。我国民间用煎剂治疗感冒发烧、麻疹高热、尿路感染、肾炎水肿、孕妇腹痛、胎动不安、先兆流产以及外科上对跌打损伤、骨折、疮肿痈毒等均有一定疗效［１］。２０世纪７０年代以来，我国医学上对苎麻根化学成分和药理作用曾进行过研究［２］。苎麻叶作为苎麻纺织工业的废弃物资源极其丰富，苎麻叶片约占植株重量的４０％左右［３］。但根据已有研究资料表明，苎麻叶中含有与根相同的成分绿原酸，此外还含有原儿茶酸、野漆树苷、芸香苷等酚酸类等抗氧化活性物质［４］。提取药材有效成分时，多用溶剂法浸泡药材。植物细胞壁不溶于大部分溶剂，像屏障一样阻碍了细胞壁内有效成分的溶出时间和溶出量。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一类酶的总称，能将细胞壁降解为小分子或易溶物质，并将细胞内有效成分释放出来，加大同溶剂的接触面积，快速提取有效成分［５］。试验采用纤维素酶预处理苎麻叶后，对总酚酸提取工艺进行了优化，以期为苎麻叶化学成分的进一步开发利用提供科学依据。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　苎麻叶（２００９年４月采自湖北省宜昌市）；纤维素酶（安琪Ⅰ号，湖北安琪酵母股份有限公司提供）；试验所用试剂均为分析纯；ＳＰ－７５２紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司），ＲＥ－５２旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），ＦＡ－Ｎ分析天平（上海精科），恒温水浴箱（上海亚荣生化仪器厂），超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），ＳＨ２－Ｄ３循环式真空泵（巩义市予华仪器责任有限公司）。
　　１．２方法
　　１．２．１福林试剂的配制称取８ ｇ钨酸钠和２ ｇ钼酸钠于圆底烧瓶中，用５６ ｍＬ去离子水溶解，加入４ ｍＬ ８５％的磷酸溶液和８ ｍＬ浓盐酸，文火回流１０ ｈ，然后加入１．２ ｇ硫酸锂及６ ｍＬ双氧水，加热沸腾１５ ｍｉｎ 至亮黄色，不得带微蓝和绿色。冷却，移入１００ ｍＬ容量瓶中，定容，放于棕色瓶中，４℃冰箱保存。
　　１．２．２对照品溶液的制备准确称取１０．００ ｍｇ没食子酸，加去离子水适量，溶解，放至冷却，以去离子水定容至１００ ｍＬ，制成每毫升含０．１ ｍｇ绿原酸的溶液，作为对照品溶液。
　　１．２．３苎麻叶总酚酸的提取方法取自然晒干的苎麻叶，剪碎。精密称取苎麻叶碎片２ ｇ，加入１％纤维素酶２０ ｍＬ，ｐＨ值为４．８的缓冲溶液，于５０℃水浴中加热处理苎麻叶１．０ ｈ，将酶灭活后，趁热过滤，在滤渣中加入７０％乙醇溶液（ｐＨ值为５．０），于一定温度、ｐＨ值条件下加热回流一定时间，抽滤，重复１次，合并２次提取液，减压浓缩于１０ ｍＬ容量瓶中定容，作为供试品溶液。
　　１．２．４总酚酸提取条件的确定试验采用纤维素酶进行酶解后，采用单因素设计，分别考察ｐＨ值、提取温度、提取时间、提取溶剂体积分数、提取料液比、提取次数６个因素对苎麻叶提取液中总酚酸含量的影响。
　　１．２．５总酚酸含量的测定
　　１）标准曲线的制作。精密吸取对照品溶液０、０．１０、０．２０、０．３０、０．４０、０．５０ ｍＬ于１０ ｍＬ容量瓶中，各加６ ｍＬ水，摇匀，再加０．５ ｍＬ福林试剂，充分摇匀，加入０．７５ ｍＬ ２０％碳酸钠溶液，混匀，以去离子水稀释至刻度。分别在４０℃下水浴４０ ｍｉｎ，于７５５ ｎｍ波长处测定吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得其回归方程为＝７．６６４ ５ｘ＋０．０２８ ４，ｒ＝０．９９９ ７，线性范围０．１～０．７ ｍｇ／ｍＬ范围内与其吸光度呈现良好的线性关系。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　２）苎麻叶总酚酸的含量测定。取１．２．３项供试品溶液０．５ ｍＬ，置于１０ ｍＬ容量瓶中，再按１．２．３项步骤操作，于７５５ ｎｍ波长处测定吸光度，计算提取率。总酚酸提取率计算公式为：总酚酸提取率＝（待测样品中总酚酸质量×稀释倍数／样品重量）×１００％
　　２结果与分析
　　２．１单因素试验
　　２．１．１提取温度对总酚酸提取率的影响按１．２．３项方法加入７０％乙醇后，分别于４０、５０、６０、７０℃水浴锅中回流１ ｈ，提取２次，测定并计算总酚酸提取率，结果见图１。由图１可以看出，随着提取温度的升高，总酚酸得率逐渐增加。在６０℃时总酚酸得率最高（０．０３５％），７０℃以后有所下降，这可能是由于温度过高会使得活性成分被破坏，鉴于总酚酸的热稳定性及杂质的溶出问题，对总酚酸来说，选择提取温度为６０℃左右较好。
　　２．１．２提取时间对总酚酸提取率的影响按１．２．３项方法，选取提取时间分别为０．２、０．５、１．０、２．０ ｈ。提取时间对总酚酸提取率的影响结果见图２。图２结果显示，总酚酸的提取率在１．０ ｈ内达到０．０３４％，１．０ ｈ以后趋于平缓，提取率变化不大，考虑再延长提取时间不利于缩短生产周期，会增加生产成本和消耗，所以选取１．０ ｈ作为适合提取时间。
　　２．１．３ｐＨ值对总酚酸提取率的影响按１．２．３项方法，选取ｐＨ值分别为３．０、４．０、５．０、６．０，ｐＨ值对总酚酸提取率的影响结果见图３。由图３可知，随着ｐＨ值的升高，总酚酸得率逐渐增加。在ｐＨ值为５．０时总酚酸得率最高（０．０３６％），ｐＨ值为６．０以后得率有所下降，说明ｐＨ值过高不利于总酚酸浸提的稳定性，酸度过高，酚性成分易形成烊盐，酸度过低，总酚酸形成盐，均不利于提取，故选择ｐＨ值为５．０较好。
　　２．１．４提取次数对总酚酸提取率的影响图４反映了提取次数对总酚酸提取率的影响，提取次数越多，总酚酸得率越大。但当提取２、３次后，得率均为０．０３５％。表明随着提取次数的增加，苎麻叶中总酚酸已基本溶出，再提取总酚酸提取率基本不增加，考虑到成本，以提取２次为最佳次数。
　　２．１．５溶剂体积分数对总酚酸提取率的影响按１．２．３项方法，选取乙醇体积分数分别为５０％、６０％、７０％、８０％作为总酚酸的提取溶剂，结果见图５。由图５可以看出，随着乙醇体积分数的升高，苎麻叶总酚酸的提取率也相应升高，当乙醇体积分数为７０％时提取率达最高（０．０３５％）。但是７０％以后，提取率不再增加。因此乙醇体积分数为７０％时最佳。
　　２．１．６料液比对总酚酸提取率的影响按１．２．３项方法，选取料液比分别为１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０（Ｗ／Ｖ，ｇ：ｍＬ，下同），料液比对总酚酸提取率的影响结果见图６。图６表明，随着料液比的改变，苎麻叶总酚酸提取率随之改变。当料液比为１∶２０和１∶２５时总酚酸提取率较高，再改变料液比提取率不再增加，故选取１∶２０作为提取料液比。
　　２．２正交试验结果分析
　　由单因素试验可知，初步确定苎麻叶经纤维酶酶解后，总酚酸提取较佳条件为温度６０℃、时间
　　１．０ ｈ、料液比１∶２０、乙醇体积分数７０％、提取２次，ｐＨ值５．０，其中ｐＨ值、提取温度、提取时间、料液比对总酚酸提取率影响较大，故选取ｐＨ值、温度、提取时间、料液比按４因素３水平作Ｌ９（３４）正交试验，其他提取条件为７０％乙醇，加酶量为１％，提取次数为２次。因素与水平设计见表１，结果见表２。
　　根据表２可知，ｐＨ值、温度、提取时间、料液比４因素中，对总酚酸提取率影响大小顺序为提取时间＞料液比＞ｐＨ值＞温度，根据各水平结果可知最佳组合为Ａ２Ｂ3Ｃ3Ｄ1，即最佳提取工艺条件为ｐＨ值５．０，料液比１∶２０、温度7０℃、提取时间2.0 ｈ、提取２次、乙醇体积分数７０％。对上述最佳条件进行验证试验，总酚酸提取率为０．０５０％，均高于其他条件组合，证明了其为最优条件。
　　２．３酶处理对提取苎麻叶总酚酸的影响
　　按１．２．５项的操作方法，计算加纤维素酶前后总酚酸的提取率，未经酶处理时总酚酸提取率为０．０３７％，而经酶处理后总酚酸提取率为０．０５０％，结果表明，纤维素酶能有效提高苎麻叶中总酚酸提取率。
　　３结论
　　在单因素试验中，提取２次（０．０３５％）与提取３次（０．０３５％）达到相同的总酚酸提取率，故提取次数选取２次，既可缩短提取周期，又可节省溶剂。同时，提取１．０ ｈ和提取２．０ ｈ两者总酚酸提取率差异不大，所以选取１．０ ｈ作提取时间，而乙醇体积分数为７０％时即具有较佳总酚酸提取率（０．０３５％）；料液比为１∶２０时达最高提取率０．０３５％；提取温度为６０℃，温度再升高提取率下降；ｐＨ值在５．０处有最高提取率０．０３６％。其中影响较大的因素为ｐＨ值、提取时间、料液比、提取温度。
　　在正交试验中，根据对各个因素和水平的极差计算，综合考虑，最佳条件为７０％乙醇、温度7０℃、料液比１∶２０、提取时间2.0 ｈ、提取次数２次、ｐＨ值为５．０。其极差结果表明，影响苎麻叶中总酚酸提取率的４个因素主次顺序为提取时间＞料液比＞ｐＨ值＞温度。在最佳条件下进行验证试验，其提取率为０．０５０％；纤维素酶预处理较未处理时总酚酸提取率有所增加。由此可见试验采用酶解后提取苎麻叶总酚酸的方法是可行而有效的。
　　
　　参考文献：
　　［１］ 李时珍．本草纲目（校订本第二分册）［Ｍ］．北京：人民卫生出版社．１９９７．９７７－９７８．
　　［２］ 李宗道．麻作的理论与技术［Ｍ］．上海：上海科技出版社，１９８０． ９７－９８．
　　［３］ 曹涤环．苎麻叶的开发与利用［Ｊ］．特种经济动植物，２００１，４（１２）：１９．
　　［４］ 周媛，邹坤，汪�植，等．苎麻叶中总酚酸提取工艺的正交设计优化［Ｊ］．时珍国医国药，２００９，２０（８）：１８６７－１８６９．
　　［５］ 魏金莹．纤维素酶在中药材提取中的应用研究［Ｄ］．天津：天津大学，２００５．
　　
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文