绿茶提取物主要成分 复方中药提取物抗白色念珠菌活性及其主要成分
摘要：研究由苦参、土茯苓和白鲜皮组成的复方中药提取物的抗白色念珠菌活性及主要成分。采用肉汤微量稀释法，测定复方中药提取物对白色念珠菌的抗菌活性，并采用化学方法对中药复方提取液进行成分预试。结果显示，提取物具明显的抑制白色念珠菌生长的活性；经理化鉴别试验显示，该复方提取物主要含有多糖、黄酮、生物碱三大类成分。表明多糖、黄酮和生物碱这三大类成分可能是复方提取物发挥抗白色念珠菌活性的重要成分，但确定其发挥作用的具体成分还需进一步的研究。
关键词：复方中药；白色念珠菌；苦参；土茯苓；白鲜皮
中图分类号：Ｒ２８５．５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）10－2000-03
Study on Anti-Candida albicans Activity and Major Components of Compound
Chinese Medicine Extracts
ＺＨＡＮＧ Ｃｈａｏ１，２，ＬＥＩ Ｃｈｕｎ－ｊｕａｎ３，ＷＥＩ Ｑｉｎ１，ＹＩＮ Ｚｈｏｎｇ－ｑｉｏｎｇ３，ＺＨＯＵ Ｌｉ－ｊｕｎ１，２，ＹＩＮ Ｌｉ－ｇｕｏ１，２
（１.Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｙｉｂｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｂｉｎ ６４４０００，Ｓｉcｈｕａｎ，Ｃhｉｎａ；
２.Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｙｉｂｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｂｉｎ ６４４０００，Ｓｉcｈｕａｎ，Ｃhｉｎａ；
３.Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａａｎ ６２５０１４，Ｓｉcｈｕａｎ，Ｃhｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： The anti－Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Chinese Medicine ｅｘｔｒａｃｔｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ Ｓｏｐｈｏｒａ fｌａｖｅｓｃｅｎｓ， Ｓｍｉｌａx ｇｌａｂｒａ ａｎｄ Ｃｏｒｔｅｘ dｉｃｔａｍｎｉ ｗｅｒｅ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ. Ｔｈｅ ｂｒｏｔｈ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ aｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｔｏ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｅｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ａｎｔｉ－Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ， ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ａｌｋａｌｏｉｄｓ were ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｓ． Ｉｔ＇ｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ were ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｅｘｅｒｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｃｒｅｔｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｔｉｌｌ ｎｅｅｄed ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ； Candida albicans； Ｓｏｐｈｏｒａ fｌａｖｅｓｃｅｎｓ； Ｓｍｉｌａx ｇｌａｂｒａ； Ｃｏｒｔｅｘ dｉｃｔａｍｎｉ
白色念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）是机会致病菌，可致人和动物念珠菌病［１］。近年来，其感染率不断上升［２］，且耐药菌株亦逐年增多。而现有治疗药物存在易产生毒副反应、过敏反应等缺点。中药材制剂因具有高效低毒、且不易产生耐药性等优点，从中寻找新型抗白色念珠菌药物成为研究的新趋势［３］。
苦参（Ｒａｄｉｘ Ｓｏｐｈｏｒａｅ Ｆｌａｖｅｓｃｅｎｔｉｓ，ＲＳＦ）、土茯苓（Ｒｈｉｚｏｍｅ Ｓｍｉｌａｃｉｓ Ｇｌａｂｒａｅ，ＲＳＧ）及白鲜皮（Ｃｏｒｔｅｘ Ｄｉｃｔａｍｎｉ，ＣＤ）为传统中药材。近年的研究表明，苦参对细菌及多种皮肤真菌有不同程度的抑制作用［４－７］。土茯苓抑菌范围广，活性强，是重要的抗细菌药
物［８－９］。而白鲜皮为中医皮肤科常用药物，对部分皮肤真菌及白色念珠菌、金色葡萄球菌等均有一定的抑菌作用［１０－１２］。本研究对这３种中药材的复方中药提取物进行了药敏试验，观察其对白色念珠菌的抑菌效果，并对提取物进行了成分预试。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１中药材苦参、土茯苓、白鲜皮。
１．１．２供试菌种白色念珠菌，由宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室提供。
１．１．３试剂及培养基所用试剂均为分析纯，购于成都市科龙化工试剂厂；ＲＰＭＩ１６４０，购于Ｇｉｂｃｏ公司；ＭＯＰＳ，购于Ａｍｒｅｓｃｏ公司。
１．２方法
１．２．１提取物的提取苦参、土茯苓、白鲜皮分别粉碎，质量比２∶２∶１混匀，入抽提瓶内，加７０％的乙醇进行回流提取。温度８０ ℃（微沸状态），固液比１∶１０。提取２次，合并２次提取液，抽滤后浓缩成浸膏。计算浸膏得率。
１．２．２复方中药对白色念珠菌的体外抑菌活性测定药敏试验参照ＮＣＣＬＳ修订的Ｍ２７－Ａ２［１３］，ＲＰＭＩ １６４０培养基按参考文献［１３］制备。
１）菌悬液的制备。挑取沙氏培养基上至少转种２次的白色念珠菌菌落于生理盐水中，制成菌悬液，并调整其浓度至约为１０６ ＣＦＵ／ｍＬ，备用。试验前用ＲＰＭＩ１６４０液体培养基稀释１ ０００倍（约为１０３ ＣＦＵ／ｍＬ）后使用。
２）抗菌药液的制备。精密称量０．５０ ｇ浸膏溶于１ ｍＬ无菌水中，超声波振荡１０ ｍｉｎ，配制成浓度为０．５０ ｇ／ｍＬ的贮存药液。取贮存药液０．５０ ｍＬ加入４．５0 ｍＬ ＲＰＭＩ１６４０培养液配成工作液，工作液浓度为５０．０ ｍｇ／ｍＬ。
３）试验操作。在无菌９６孔微量板每排的第一、二孔加入１００ μＬ工作液，每排从第二至第九孔均加入１００ μＬ培养液，并按两倍稀释法进行工作液逐步稀释，配制成浓度分别为５０．０～０．１９５ ｍｇ／ｍＬ的溶液。每个浓度做３个平行孔。每排第十孔作为对照，即加入２０ μＬ无菌水和８０ μＬ培养液。每排第十一、十二孔分别作培养液空白对照和真菌生长阳性对照，均加入１００ μＬ培养液。每排的第一至第九孔和第十、第十二孔再加入１００ μＬ菌液（１０３ ＣＦＵ／ｍＬ），最终药物浓度为２５．０～０．０９８ ｍｇ／ｍＬ。将微量板加盖后置于３７℃孵育２４ ｈ。然后进行结果判定。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 ４）结果判定。将测试孔菌株生长情况与对照孔进行比较，以培养液清澈为阴性，记为没有菌落生长；混浊有菌膜为阳性，记为有菌落生长。以培养液清澈的最小浓度作为该药的最低抑菌浓度（ＭＩＣ）。
１．２．３复方中药提取物的化学成分预试采用化学方法对中药复方提取液进行了成分预试［１４］，为制剂的质量标准的建立奠定基础。按１．２．１的方法制得的提取液，进行主要已知杀菌成分预试验，包括皂苷、糖类、酚类、黄酮类、生物碱、蒽醌。
１）皂苷的鉴别。①泡沫试验：取样品溶液２ ｍＬ于带塞试管中，用力振摇３ ｍｉｎ，检查是否产生持久性蜂窝状泡沫（维持１０ ｍｉｎ以上），且泡沫量不少于液体体积的１／３。②醋酐浓硫酸试验（Ｌｉｅｂｒｍａｎｎ Ｂｕｒｃｈａｒｄ反应）：取样品溶液置蒸发皿中，于水浴上蒸干，残渣加入少量冰醋酸使溶解，再加入醋酐浓硫酸（１９∶１）试液，检查是否呈现红紫色并变成污绿色（甾类、三萜类成分或皂甙）。
２）糖类的鉴别。①斐林试剂试验：取样品溶液２ ｍＬ，加入碱性酒石酸铜试液１ ｍＬ，沸水浴加热５ ｍｉｎ，观察是否产生棕红色或砖红色氧化亚铜沉淀。②Ｍｏｌｉｓｈ反应：取样品溶液１ ｍＬ，加５％萘酚试液数滴振摇后，沿管壁滴入５滴浓硫酸，使其成两液层，待３ ｍｉｎ后，观察两层液面间是否出现紫红色环。③碘试验：取样品溶液１ ｍＬ，加碘试液，观察颜色变化，是否显蓝色或紫红色（检查淀粉及糊精）。
３）酚类的鉴别。①溴试验：取样品溶液１ ｍＬ，加溴试液２滴，观察现象，若变成白色或生成沉淀物，则可能含有酚或儿茶酚鞣质。②香草醛－酸试验：取样品溶液点于滤纸片上，干后，喷雾或滴加香草醛－盐酸试剂，观察变化。
４）黄酮类的鉴别。①盐酸－镁粉反应：取样品溶液１ ｍＬ，加放少量镁粉（或锌粉），然后加浓盐酸４滴，沸水浴加热２ ｍｉｎ，如出现红色则有游离黄酮或黄酮甙。并以同法不加镁粉或锌粉的作对照，如两管都显红色则有花色素存在。②三氯化铝荧光试验：在样品溶液中加入几滴１％三氯化铝乙醇液，在紫外光灯下观察是否有黄绿色荧光。③浓氨水反应：向样品溶液中加入几滴浓氨水，观察是否有亮黄色或橙色反应。④铅盐反应：将１％的乙酸铅加入样品溶液中，观察是否有黄色至红色沉淀产生。
５）生物碱的鉴别。沉淀反应：分别向样品溶液中加入碘化铋钾试剂、硅钨酸试剂及磷钼酸试剂，观察是否有沉淀产生及颜色变化。
６）蒽醌的鉴别。①碱液反应：取样品溶液１ ｍＬ，向其中加入１０％氢氧化钠２滴、双氧水２滴，加入适量稀盐酸，观察溶液变化情况。②醋酸镁反应：取样品溶液１ ｍＬ，向其中加入１％醋酸镁溶液２滴，观察溶液变化情况。
２试验结果
２．１复方中药提取物得率及其ＭＩＣ
经计算，复方中药材提取物得率约为２３％；对白色念珠菌ＭＩＣ值为０．１９５ ｍｇ／ｍＬ。
２．２皂苷的鉴别
经泡沫试验，样品溶液无泡沫产生；经醋酐浓硫酸试验后样品溶液颜色无变化。
２．３糖类的鉴别
由图１可见，①Ｍｏｌｉｓｈ反应，溶液液面出现紫红色环。②斐林试剂试验，溶液中产生砖红色沉淀。③碘试验，溶液不显蓝色或紫红色。由这三种结果可知，中药提取物中含有不是淀粉和糊精的多糖类成分。
２．４酚类的鉴别
经溴试验，样品溶液无沉淀反应或颜色变化；经香草醛－盐酸试验，样品颜色无变化。
２．５黄酮类的鉴别
试验结果见图２，①盐酸－镁粉反应两管都显红色。②三氯化铝荧光试验在紫外光灯下观察有黄绿色荧光。③铅盐反应，反应后溶液中有浅黄色沉淀产生。④浓氨水反应溶液变为橙色。
２．６生物碱的鉴别
由图３可见，①加磷钼酸试剂，溶液中产生白色沉淀。②加碘化铋钾试剂，反应后溶液中产生橘红色沉淀。③加硅钨酸试剂，溶液中产生浅黄色沉淀。
２．７蒽醌的鉴别
碱液反应和醋酸镁反应，样品溶液颜色均无变化。
３结果与讨论
本试验抑菌结果表明，由苦参、土茯苓及白鲜皮组成的复方中药提取物对白色念珠菌有显著抑制作用。0.１９５ mｇ／ｍＬ的ＭＩＣ值低于白鲜碱对白色念珠菌的ＭＩＣ值［１５］，说明以白鲜皮为组成成分的复方中药材提取物对白色念珠菌的抑菌效果优于单方的白鲜碱，也反映出复方提取物有更好的抑菌效果。成分预试发现，该提取物中主要含有多糖、黄酮及生物碱类成分。现代药理研究表明，苦参发挥抑菌作用的主要活性成分是苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、三叶豆檀甙和高丽槐素［１６］。土茯苓化学成分主要为黄酮类、皂甙、多糖，有药理作用的物质主要为黄酮类成分［１７］。白鲜皮主要化学活性成分为生物碱类、黄酮类及柠檬苦素类物质，已有研究表明其中所含的�皮酮和白鲜碱是其主要杀菌活性成分［１８］。该提取物对白色念珠菌的抑菌活性有可能是几类成分的协同作用导致。这一结果与现代药理研究相符。
参考文献：
［１］ 陆承平．兽医微生物学［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００５．
［２］ 贾杰．现代真菌病学［Ｍ］．郑州：郑州大学出版社，２００１．
［３］ 广州时每医药信息有限公司． ２００５年抗真菌药物市场研究报告［Ｒ］． ２００５．
［４］ 郑津辉，王威，黄辉，等．苦参提取液中黄酮类化合物的抑菌作用［Ｊ］． 武汉大学学报（理学版），２００８，５４（４）：４３９－４３２．
［５］ 汤长明，李军，庞晓东，等． 雷公藤与苦参配伍的体外抑菌试验［Ｊ］． 实用医药杂志，２００３，２０ （２）：１５８．
［６］ 樊宏伟，卢继红，张蓉，等．苦参碱类生物碱的体外抑菌、抑病毒及诱生干扰素的实验研究［Ｊ］． 医药信息，２０００（４）：７５－７６．
［７］ 邸大琳，李法庆，陈蕾，等．苦参体外抑菌作用的研究［Ｊ］．时珍国医国药， ２００６，１７（１０）：１９７４．
［８］ 王志强，邱世翠，宋海英，等． 土茯苓体外抑菌作用研究［Ｊ］．时珍国医国药，２００６，１７（１１）： ２２０３－２２０４．
［９］ 纪莉莲，范怡梅．土茯苓体外抗菌活性实验［Ｊ］．中国生化药物杂志，２００２，２３（５）：２３９－２４１．
［１０］ 武海燕．药用植物白鲜皮的化学成分及药理作用综述［Ｊ］．内蒙古石油化工，２００７（３）：５０－５１．
［１１］ 郭静，张毅．白鲜皮复方临床应用集萃［Ｊ］．中医药学刊，２００５，２３（３）：５１３－５１４．
［１２］ 江霞．复方白鲜皮洗剂抗菌实验［Ｊ］．中国药师，２００５，８（４）：３４５－３４６．
［１３］ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ． ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ； Ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ． Ｍ２７－Ａ ［Ｓ］． Ｗａｙｎｅ． ２００２．
［１４］ 姚新生．天然药物化学［Ｍ］．北京：人民卫生出版社， ２００１．
［１５］ 梁晓英，郭娜，王丽莎，等．白鲜碱体外抗白色念珠菌活性研究［Ｊ］. 中国农学通报，２００９，２５（１６）：２１－２４
［１６］ 苗抗立，张建中，董颖，等．苦参的化学成分及药理的研究进展［Ｊ］． 天然产物研究与开发，２００１，１３（２）：６９－７３．
［１７］ 田君，池汝安，高洪． 乙醇提取土茯苓黄酮甙的动力学研究［Ｊ］． 天然产物研究与开发，２００５，１７（１）：１１－１５．
［１８］ 王麦玲，张继文，钱勇．白鲜皮杀菌活性成分的研究［Ｊ］．农药，２００６，４５ （１１）：７３９－７４１．
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