小麦三种锈病的区别 小麦抗条锈病基因Yr5分子标记检测

　　摘要：为给小麦新品系的抗性遗传基础鉴定及持久抗性新品种选育提供技术支撑，以２２个小麦条锈病抗性品种、２个感病品种及１２个野生近缘物种为材料，采用ＰＣＲ方法探讨了小麦条锈病的抗性基因分子标记Ｙｒ５－１５６在这些材料中的分布。结果表明，在多数抗病材料中能扩增出抗病基因Ｙｒ５分子标记特异性条带；但在２个感病材料中也扩增出来了同样的特异性条带。表明抗条锈病基因Ｙｒ５的分子标记Ｙｒ５－１５６不能作为分子标记辅助育种手段直接应用，需对其做进一步的验证。
　　关键词：小麦；抗条锈病基因Ｙｒ５；分子标记
　　中图分类号：Ｓ５１２．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1901-03
　　
　　Detection of Molecular Marker Linking to Wheat Stripe Rust-resistance Gene Yr5
　　
　　ＺＨＡＮＧ Ｓｈｅｎｇ－ｌｉ，ＺＨＯＵ Ｙａｎ，ＺＨＡＯ Ｊｕｎ－ｊｉｅ，ＲＵ Ｚｈｅｎ－ｇａｎｇ
　　（Ｋｅｙ Ｄｉｓｃｉｐｌｉｎｅ Ｏｐｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｎ Ｃｒｏｐ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｌｅａｒｎｉｎｇ／Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｆｆｅｒ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｎｅｗ wheat ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｎｅｗ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ， ２２ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ， ２ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ａｎｄ １２ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｌｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ． Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ （Ｙｒ５－１５６） ｌｉｎｋｉｎｇ ｔｏ ｗｈｅａｔ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ-ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ Ｙｒ５ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｎｄｓ ｏｆ Ｙｒ５－１５６ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｍｏｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ materials ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｙｒ５－１５６ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｂｅ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｍａｒｋｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ， ａｎｄ ｎｅｅｄ to be ｆｕｒｔｈｅｒ verificated．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｈｅａｔ； ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎt ｇｅｎｅ Ｙｒ５； ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ
　　小麦条锈病是由小麦条锈菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ． ｓｐ． ｔｒｉｔｉｃｉ）引起的一种世界范围的严重病害，也是我国发生范围最广、危害程度最重的小麦病害之一。选育抗病品种是防治小麦条锈病最经济、有效和环保的举措［１，２］。由于新的条锈菌生理小种的产生，特别是强毒性小种条中３２（ＣＹＲ３２）、３３（ＣＹＲ３３）出现以后，绝大部分抗条锈病基因在我国已经丧失了抗性，从而导致２００２年条锈病大流行。现有的条锈病抗源中只有Ｙｒ５、Ｙｒ１０、Ｙｒ１５、Ｙｒ２４、Ｙｒ２６等少数基因还保持着对ＣＹＲ３２、ＣＹＲ３３的抗性［３，４］。因此，发掘新的抗病基因及与其紧密连锁的分子标记、培育抗病基因聚合品种和多系品种，对条锈病的持久防治具有重要意义［５－７］。
　　本研究以２２个抗性、２个感病小麦品种（表１）及１２个小麦野生近缘物种（表２）为实验材料，通过ＰＣＲ扩增来检测Ｙｒ５基因分子标记Ｙｒ５－１５６［8］在这些材料中的分布，可为不同抗源材料的抗性遗传基础鉴定及新抗源材料的筛选提供理论支持，对加快小麦新抗病品种培育及提高抗病品种的抗性持久性有重要意义。
　　１材料与方法
　　１．１材料
　　本研究所用的植物材料见表１和表２。
　　
　　１．２方法
　　ＤＮＡ提取主要采用ＣＴＡＢ法［9，10］。
　　用已经报道的抗条锈病基因Ｙｒ５的分子标记Ｙｒ５－１５６［8］对上述２２个抗性品种、２个感病品种和１２个野生近缘物种进行ＰＣＲ扩增，引物序列为Ｙｒ５－１５６Ｓ：５′－ＣＡＡＴＡＧＴＴＡＧＧＣＡＡＡＴＴＡＣＡＴＣＧ－３′；Ｙｒ５－１５６Ａ：５′－ＴＧＣＡＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡ
　　－３′。
　　采用２０ μＬ反应体系：上下游引物各１．０ μＬ、１０ μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２．０ μＬ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２．０ μＬ、２．５ Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０．５ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ １１．５ μＬ、１０ ｎｇ／μＬ 模板ＤＮＡ ２．０ μＬ。ＰＣＲ循环反应程序：９４ ℃、３ ｍｉｎ；９４ ℃、１ ｍｉｎ，６０ ℃、１ ｍｉｎ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃、５ ｍｉｎ。采用２％琼脂糖凝胶进行电泳，然后用凝胶成像系统进行观察照相。
　　２结果分析
　　Ｙｒ５基因的特异引物Ｙｒ５－１５６扩增的目标带大小是１５６ ｂｐ左右［8］，图１、２表明，多数材料中都能够扩增出特异片段，同时从扩增结果中不难看出各泳道均有引物二聚体出现。９号（ＣＰ０２－９－２－２－１）、１４号（内２８３６）是２个抗性较好的材料，但没有扩增出Ｙｒ５－１５６的特异性条带，说明这２个材料里面可能不含有Ｙｒ５基因或与其连锁的分子标记，而含有其他的抗病基因，也可能这２个材料中含有Ｙｒ５基因但由于这个标记与抗病基因Ｙｒ５遗传距离较大发生交换所致。而２３号（山农０１５１８９）和２４号（连０３６６）２个感病材料却扩增出了目标条带，这２个材料中可能含有Ｙｒ５基因或与其紧密连锁的分子标记，但Ｙｒ５基因是抗性较好的小麦抗条锈病主效基因，目前，在我国还未发现能克服它的生理小种［１１］。感病材料中检测到了Ｙｒ５－１５６，可能与这个标记与抗病基因Ｙｒ５遗传距离较大发生交换而导致标记存在但抗病基因实际上不存在；也可能是这２个材料虽然含有Ｙｒ５基因的特异引物Ｙｒ５－１５６序列相似区，但该ＤＮＡ区段所含有的Ｙｒ５基因已经突变为不抗病或者材料繁殖过程中由于混杂发生交换而丢失。
　　
　　图３表明，在１２个野生近缘材料中有J9（斯卑尔托小麦）、J10（提莫菲维小麦）、J11（节节麦）、J12（波斯小麦ＰＳＳ）４个材料扩增出目标大小的条带，同时在这１２个材料扩增结果中也不同程度地出现了引物二聚体。这４个材料扩增出了目标条带，说明这４个材料中可能含有Ｙｒ５或与其紧密连锁的分子标记，但除Ｊ１２（波斯小麦ＰＳＳ）外，扩增条带都比较弱，其中Ｊ９（斯卑尔托小麦）是该基因来源物种，这可能是因为筛选分子标记Ｙｒ５－１５６时所用的遗传群体在来自斯卑尔托小麦的含Ｙｒ５基因的ＤＮＡ片段上与分子标记Ｙｒ５－１５６的引物结合区序列发生了一定变异，导致扩增效果不理想。
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　　多年来广大农业科研工作者已经开发出了许多条锈病抗病基因的分子标记，但这些标记能不能直接被用于抗病材料的遗传鉴定进而进行标记辅助育种还有待研究。本研究证明分子标记Ｙｒ５－１５６在抗病、感病材料中均出现，所以还不能直接应用于抗病基因Ｙｒ５的分子标记辅助育种。陈晓红［8］开发的这个标记与抗病基因Ｙｒ５的交换率为０的数据来自于对Ｆ２代分离群体１２１个单株的检测结果，这个群体量太小，连锁值可能有较大的偏差。由于遗传距离与小麦材料的遗传背景有一定关系，文献中的结论可能只适于其所研究的群体。对于分子辅助育种来说，如果想继续利用这个分子标记，还需要继续深入的探讨。
　　参考文献：
　　［１］ 房体麟，程颖，李根桥，等． 小麦条锈病抗源Ｓ２１９９抗病基因分子标记及其与Ｙｒ５的关系［Ｊ］． 作物学报，２００８，３４（３）：３５５－３６０．
　　［２］ 张金霞，钮力亚，于亮，等． 小麦条锈病的研究进展［Ｊ］． 植物保护，２００８，１４（４）：４９－５２．
　　［３］ 万安民，牛永春，吴立人，等． １９９１－１９９６年我国小麦条锈菌生理生化研究［Ｊ］． 植物病理学报，１９９９，２９（１）：１６－２０．
　　［４］ 陈万权，晏思白，胡长程，等． １９９０－１９９３年我国小麦叶锈菌生理小种及其致病性特点研究［Ｊ］． 植物保护学报，１９９４，２１（４）：２９１－２９２．
　　［５］ 马渐新，周荣华，董玉琛，等． 小麦抗条锈病基因定位及分子标记研究进展［Ｊ］． 生物技术通报，１９９９（１）：１－５．
　　［６］ 董淑静，许为钢． 小麦条锈病抗性基因研究进展及分子标记辅助聚合育种［Ｊ］． 中国农学通报，２００９，２５（１３）：１９０－１９６．
　　［７］ 秦静，陈静，吴瑜． 小麦抗条锈病遗传研究进展［Ｊ］． 种子，２００４，２３（１０）：４０－４１．
　　［8］ 陈晓红． 小麦抗条锈病基因Ｙｒ５分子标记的鉴定［Ｄ］． 哈尔滨：东北农业大学，２００３．１－６．
　　［９］ 王景雪，孙毅，高武军． 一种简便实用的植物总ＤＮＡ提取方法［Ｊ］． 山西大学学报（自然科学版），２０００，２３（３）：２７１－２７２．
　　［10］ 黄萱，高丽美，张永彦， 等． 一种优化的植物总ＤＮＡ提取方法［Ｊ］． 西北植物学报，２００４，２４（６）：１１０３－１１０６．
　　［１１］ 伍玲，谭君，朱华忠，等． 四川近年小麦区试品系中Ｙｒ５、Ｙｒ１０和Ｙｒ１５的分子标记检测［Ｊ］． 西南农业学报， ２００７， ２０（２）：３１６－３２０．
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