植物基因的克隆|植物基因克隆的基本步骤

植物基因的克隆

08医用二班姚桂鹏 0807508245

简介

克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。 通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。 本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。

关键词

植物基因 基因克隆 载体 工具酶 克隆策略 分离克隆方法

Plant gene cloning

Introduction

Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords

Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy

一、 植物基因的结构和功能

基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。

（一） 植物基因的启动子

启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。

（二） 植物基因的增强子序列

增强子（enhancer）是另一类调控基因表达的DNA序列，其中包含有多个能被反式作用因子识别与结合的顺式作用元件。

（三） 植物基因的起始子序列

起始密码子前后的序列被称为其实子序列。它在核糖体识别和翻译的其空中有重要作用，起始子序列的特性直接影响着翻译过程中核糖体识别及翻译的效率。

（四） 植物基因的加尾信号序列

（五） 植物基因的密码子偏好

虽然所有生物大多使用通用的密码子系统，但植物基因在同义密码子间的选择上有一定的偏好。

二、 基因克隆的载体

基因克隆的目的是使目标DNA片段得到扩增或表达，但是外援DNA片段本身不具备自我复制和表达的能力，所以必须借助于“载体”及其“记住细胞”来实现外源DNA片段的扩增和表达。

所谓载体（vector）是一类能够携带外源DNA片段进入寄主细胞内，并实现外源DNA片段复制或表达的DNA分子。按照载体功能的不同，可分为克隆载体和表达载体两大类。克隆载体的用途是在寄主细胞中扩增外源DNA片段；表达载体的用途主要是在寄主细胞中实现外源DNA的表达。按照载体的组成不同，又可分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体和人工染色体载体等几种。

（一） 质粒载体

1、质粒是一种广泛存在于细菌细胞中染色体以外的能自主复制的裸露的环状双链DNA 分子，它的结构比病毒更简单，既没有蛋白质外壳，也没有细胞外生命周期。

2、质粒载体的特征

作为基因克隆的载体必须具备以下特征：能在记住细胞中进行独立复制和表达；具有1~2个选择标记；具备多克隆点，自身分子量较小。

（二） 噬菌体载体

（三） 黏粒载体

（四） 人工染色体载体

三、 基因克隆的工具酶

在基因克隆的过程中，DNA分子的切割、连接、修饰及合成等操作都会涉及到一系列工具酶的应用。比如，限制性核酸内切酶、DNA连接酶、末端转移酶、碱性磷酸酶、DNA聚合酶以及反转录酶等，下面就对这些工具酶的特点及应用进行简要的介绍。

（一） 限制性核酸内切酶及其应用

1、分类

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。根据限制酶的作用特点可将限制性核酸内切酶分为三种类型，及I型、II型和III型。

I型限制性核酸内切酶是一种单一的多功能酶，兼具限制酶、修饰酶、ATP酶和DNA 解旋酶的功能。

II型限制性核酸内切酶是基因工程中的最重要的工具酶之一。其主要原因是，组成II型酶的限制-修饰系统的限制酶和修饰酶是独立分开的，且II型限制酶的分子量较小；在酶切反应时，进需哟啊Mg作为辅助因子，而且可以精确特异性地切割双链DNA分子。

III型限制性核酸内切酶也是一种双功能酶，且切割位点在识别为点以外，切割反应需要ATP、Mg和S腺苷甲硫氨酸作为辅助因子。

2、II型限制性核酸内切酶的基本特征

（1） 识别位点的特异性

（2） 识别序列的对称性

（3） 切割位点的规范性

（二） DNA连接酶及其应用

1.、DNA连接酶作用的特点

DNA连接酶有大肠埃希菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两种，在基因克隆中最常用的是T4DNA连接酶。该酶不仅可以连接粘性末端的DNA分子，也可以连

接平末端的DNA分子，所以在基因克隆中得到广泛的应用。

2、NA连接反应的条件

影响DNA的连接反应效率的因素主要有：温度（通常为16°）、ATP浓度、连接酶的浓度、连接反应的时间（通常要求在1H以上）以及连接片段的浓度等。

（三） DNA聚合酶及其应用

1、大肠埃希菌DNA聚合酶I

2、Klenow片段

3、T4DNA聚合酶

4、逆转录酶

（四） 修饰性工具酶

在基因克隆操作中，除了上述的主要几种工具酶外，还需要一些修饰性的工具酶对DNA分子进行适当的修饰。其中有末端转移酶、碱性磷酸酶、T4多核苷酸激酶、S1核酸酶

四、 基因克隆的策略

一般来说，基因克隆的过程主要包括目标片段的获得、重组体载体的构建、寄主细胞的转化以及重组克隆的筛选等几个步骤。

（一） 目标DNA片段的获得

1、化学法直接合成

用于克隆的目标DNA片段完全可以通过化学法直接合成。利用化学法直接合成目标DNA的优点是：可以任意创造和修饰基因，可以方便的设置各种接头以及选择各种宿主生物喜好的密码子。其主要的缺点是：易造成中型突变，从蛋白质的氨基酸顺序去推测DNA序列时，不同生物间密码子的偏好及简并性都会影响到序列的准确性，甚至有时合成基因的表达失败。

（二）载体的选择及制备

（三）目的DNA片段和载体的连接

（四）重组载体转化宿主细胞

（五）重组克隆的筛选

五、 植物目的基因的分离克隆方法

分离和克隆目的基因是植物基因工程的首要任务。比如，在植物抗旱基因工程总，

我们首先必须分离克隆到与抗旱形状高度相关的一些目的基因，然后才能通过基因工程的手段对目标植物的抗旱形状进行改良。常用的植物基因分离克隆方法有以下几种：

1、 生物芯片

生物芯片实际上是有固相支持介质及固定于该类介质上的大量生物信息分子的微阵列组成，因为它和芯片具有类似的特点，及微型化和能够并行处理大规模的信息，所以称之为“生物芯片” 。

2、 基因文库的筛选

基因文库是指汇集了某一生物全部基因序列的重组群体。具体来说，构建基因文库死，首先将代表某一生物类型的全部DNA片段分别插入到特定载体中，然后将重组载体导入宿主细胞并获得大量的含有重组载体的克隆。这样，每个克隆中都含有一段该生物基因的DNA片段，全部克隆的集合就构成了该生物的基因文库。

3、 蛋白质组学

蛋白质组学可被广泛定义为对生物样本中全部蛋白质系统分心的科学。蛋白质组是指在一种细胞内存在的全部蛋白质，即基因组表达产生的总蛋白质统称蛋白质组，功能蛋白质组是指那些可能涉及到特定生理生化功能的蛋白质群体。

4、 mRNA差异显示

5、 插入失活技术

6、 图位克隆方法

参考文献：

植物生物技术 肖尊安主编 化学工业出版社 2005

植物分子遗传学 刘良式等编 北京：科学出版社 1998

基因克隆的分子基础与工程原理 刘志国、屈伸主编 北京 化学工业出版社 2003 植物基因工程 王关林等编 北京 科学出版社 2002