【输卵管积水对窗口期子宫内膜基因谱的影响】 输卵管积水对子宫内膜

　　摘　要：应用Affymetrix U133A 2.0基因表达谱芯片分析正常志愿者、输卵管积水和输卵管阻塞三者在胚泡植入窗期子宫内膜基因的差异表达，正常样本与积水样本有显著差异表达的基因588个，正常样本与阻塞样本180个，积水样本与阻塞样本750个，三者均有显著差异表达的基因28个，该结果表明输卵管积水患者的低妊娠率可能与其容受性受影响相关。
　　关键词：子宫�膜容受性；基因芯片；输卵管积水；窗口期
　　中图分类号：R711.6　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0367-06
　　
　　据WHO预测，21世纪不孕症将成为仅次于肿瘤和心脑血管疾患的第三大疾病，输卵管性疾病导致的不孕约占女性不孕症的1/3，而其中输卵管积水引起的不孕又占输卵管性不孕的10％～30％，体外受精一胚胎移植(IVF-ET)在解决输卵管病变引起的不孕症中发挥了很大的作用，但是大量研究表明输卵管性不孕患者接受IVF-ET治疗的成功率偏低，特别是伴有输卵管积水者成功率更低，这些表明输卵管积水可能影响IVF-ET的成功率，本文应用AffYmetrix U133A 2.0基因表达谱芯片分析正常志愿者、输卵管阻塞不伴积水和输卵管阻塞并积水三者在胚泡植入窗期子宫内膜基因的差异表达，阐述输卵管积水对子宫内膜容受性影响的可能机制，为进一步探讨输卵管积水对IVF-ET影响机制及如何提高妊娠率提供理论依据。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1．1 标本采集
　　我院生殖中心2005年收治的分别因双侧输卵管阻塞伴积水和双侧输卵管间质部阻塞拟行IVF-ET的两名患者及一名有生育史的健康志愿者，年龄分别为26、28和30岁，月经规则、周期正常(28～32d)，B超检查未发现子宫肌瘤、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征等疾病，在月经周期的第10d开始使用尿LH试纸，测出LH峰，在LH峰值后的第7d(LH+7，着床窗口期)取出内膜组织(3例组织标本均经病理学检查证实)，以生理盐水漂洗样本，于液氮中保存，正常样本、积水样本和阻塞样本的编号分别为A、B、C，互为对照比较。
　　
　　1．2　实验方法
　　1．2．1　寡核苷酸微阵列芯片
　　AffYmetrix U133A 2.0，代表了18400个转录本，包含了14 500个来自Unigene基因库全长人类基因。
　　1．2．2　样品制备
　　用TRIzol法抽提3份样品的总RNA，使用QIAGEN RNeasy试剂盒纯化总RNA，使用分光光度计测定OD值及琼脂糖凝胶电泳质控总RNA，以T7(d7)24 Primer为引物，反转录完成cDNA第1条链的合成，以第1条链为模板进行cDNA第2条链的合成，纯化后的双链cDNA，使用Genechip IVT Labeling Kit试剂盒直接进行体外转录合成cRNA，同时完成cRNA生物素标记。再将纯化并用分光光度计定量的体外转录后的cRNA产物经高温高盐片段化为35～200bp。
　　1．2．3 芯片杂交及洗涤
　　将片段化的cRNA和其他试剂混合，配制杂交液，将杂交液注入芯片中，将3张芯片在杂交炉中杂交16h后取出芯片，用基因芯片洗涤工作站400洗脱和染色探针阵列。
　　1．2．4芯片扫描及结果分析
　　用基因芯片扫描仪3000扫描芯片，将芯片扫描结果用Affymetrix公司自带的软件GCOS1.2分析生物素荧光信号的强度，3例样本的扫描数据均统一到500，通过计算完全匹配的探针信号同碱基错配的探针信号之间的比值Ratio，采用系统的默认值，来确定核酸杂交信号为存在(presentP)、边界(marginal M)、不存在(absent A)，规定显著差异表达基因筛选标准为Signal Log Ratio(实验样本和对照样本比值取Log2后的值)≥2或≤-2，即Signal Log Ratio值≥2说明该基因在实验样本较对照样本表达显著上调，Signal LogRatio值≤-2说明该基因在实验样本较对照样本表达显著下调。
　　
　　2 结果
　　
　　2．1　总RNA抽提及cRNA片段化结果
　　从3例样本中提取的总RNA OD260/OD280值均在1.8～2.1(见表1)，琼脂糖凝胶电泳结果分析RNA(见图1)28S、18S条带清晰，并且28S条带的亮度和宽度为18S条带的2倍，说明所提取的总RNA纯度较高、完整性良好，样品合格，符合芯片杂交的要求，cRNA片段化后为35~200 bp，均一性程度高，进行基因芯片杂交条件好。
　　　
　　2．2　差异表达基因筛选结果
　　积水样本与正常样本相比，显著表达差异的基因共588个，表达上调为351个，下调为237个，阻塞样本与正常样本相比，显著性差异的基因共180个，表达上调为106个，下调为74个，积水样本与阻塞样本相比，显著性差异的基因共750个，表达上调为302个，下调为448个，将积水样本与正常样本比较得到的数据和阻塞样本与正常样本比较得到的数据取交集，即在两组数据中都出现2倍以上差异表达的基因共28个，表达均上调为7个，均下调为15个，两组上下调方向不一致6个，这些差异基因的功能分类见表2和表3。
　　　　
　　3 讨论
　　
　　基因芯片又称DNA微阵列，是指采用原位合成或直接点样的方法将大量DNA片段或寡核苷酸片段排列在硅片、玻璃等固体介质上形成微矩阵，样品核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的各点同时进行杂交，通过检测杂交信号的强度而获取样品分子的基因信息，从而对基因序列及功能进行研究，本课题进行输卵管积水、输卵管阻塞及有生育史健康妇女窗口期子宫内膜基因表达差异研究，以期筛查出输卵管积水对子宫内膜容受性影响的差异基因。
　　
　　3．1　子宫内膜容受性相关基因
　　胚胎着床是从受精卵植入子宫内膜开始的一系列细胞、分子信号传递过程，胚胎着床成功与否与子宫内膜容受性密切相关，影响子宫内膜容受性的相关因素较多，其分类尚无公认的标准，本研究将筛选出子宫内膜容受性相关基因按功能分为以下几类。
　　3．1．1　酶
　　S.Mirkin等分析分泌早期(LH+3)与分泌晚期(LH+7)的子宫内膜：上调大于等于2倍的49个基因中，产物为酶的占11％；下调大于等于2倍的58个基因中，产物为酶的占25％，本研究显示积水样本与正常样本、阻塞样本与正常样本及积水样本与阻塞样本相比差异基因中酶约占20％，这些酶有基质金属蛋白酶类、环氧合酶、脂氧合酶类、醛氧化酶、单胺氧化酶、谷胱甘肽过氧化酶，3(GPx-3)等。
　　3．1．2　细胞黏附分子和细胞骨架蛋白
　　S.MirkinEll等报道49个上调基因，产物发挥 细胞黏附分子和细胞骨架蛋白功能的占19％；58个下调基因，发挥细胞黏附分子和细胞骨架蛋白功能的占11％，本研究显示各样本比较差异基因中产物发挥细胞黏附分子和细胞骨架蛋白功能的约占5％，结果差异较大是因为各基因产物具有多重功能，分类有交叉重叠性，细胞黏附分子(CAMs)是一类参与细胞与细胞，细胞与细胞外基质黏附作用的糖蛋白，在着床过程中发挥重要作用，分为5大类：整合素、选择素、钙黏附分子、黏液素、免疫球蛋白超家族，其中研究较多的是整合素，细胞骨架蛋白是一类与细胞骨架相关的蛋白质，差异表达的有角蛋白、COMP、LOMD、OPN、肌动蛋白等。
　　3．1．3 细胞周期调节因子、金属离子结合蛋白和信号转导蛋白
　　S.Mirkin等报道49个上调基因，产物为细胞周期调节因子、离子结合蛋白和信号转导蛋白占38％，58个下调基因，为细胞周期调节因子、离子结合蛋白和信号转导蛋白占中占46％，本研究也显示各样本比较差异基因中产物为细胞周期调节因子、离子结合蛋白和信号转导蛋白的约占20％，产物为细胞周期调节因子的上调基因有生长抑制和DNA损伤基因、丝裂原活化蛋白激酶等，差异表达的离子结合蛋白大多数是钙离子结合蛋白，有膜连蛋白、金属硫蛋白等，差异表达的信号转导蛋白有DKKl、成纤维细胞生长因子9、卷缩相关蛋白等。
　　3．1．4　免疫反应相关蛋白和载体蛋白
　　与子宫内膜容受性相关的差异基因为免疫反应相关蛋白有细胞分化抗原CD55、CD44、白介素、补体Clr、Cls等；载体蛋白有溶质载体家族成员、PDZKl、SNXl0等。
　　3．1．5　其它
　　其它功能的蛋白有：细胞增殖、离子通道、分泌期蛋白、受体蛋白等，与子宫内膜容受性相关且研究较多的有分泌期蛋白：胎盘蛋白-14。
　　
　　
　　3．2　输卵管积水患者对子宫内膜容受性影响的可能差异基因
　　目前采用Affymetrix公司芯片最完整的关于子宫内膜容受性相关基因的5份研究(Kao、Carson、Risesewijik、Brothwick、Mirkin)中共同认定的植入窗期标志性上调基因有骨桥蛋白、衰变加速因子、单胺氧化酶A、分裂激活蛋白激酶5、DNA诱导损伤抑生长因子、补体1R亚单位、白介素-15、AnnexinⅣ、Apolipoprotein D、Dickkopfl、DNA结合抑制因子-4、Placetal protein-14、Adipsin、丝氨酸蛋白酶抑制因子、GTP-binding protein 2、Claudin 4、Nip 2；下调基因有：Olfactomedinrelated、ER Localized protein、Msh同源盒1、GATA结合蛋白2，在本研究中，输卵管积水样本中差异表达的植入窗期标志性基因主要有以下几种。
　　3．2．1 骨桥蛋白
　　骨桥蛋白(OPN或SPPI)是唯一一个在5份研究中一致上调的基因，本研究显示积水样本较正常样本、阻塞样本表达分别下调2.8、3，阻塞样本与正常样本无显著差异，骨桥蛋白通过其分子中的精一甘，天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列一细胞黏附结构域，识别细胞表面的受体整和素，与细胞结合，调节细胞的黏附、迁移和增殖分化等，其基因水平的增加促使分泌中期腔上皮细胞表面受体整合素αv、β3表达增加，因此OPN-αvβ3，复合体将会在种植窗内膜腔上皮细胞顶侧缘形成，以促进胚泡的着床，推测若其中一种表达减弱或两者均减弱，导致该复合体不能有效的形成，将会影响胚泡的植入，另外，OPN还可以和CD44结合形成复合物覆盖在于宫腔上皮的表面以募集淋巴细胞，从而使Th2型细胞因子增多，调节围着床期子宫内膜对胚胎的适应性，以利胚胎成功地植入和维系妊娠。
　　3．2．2 胎盘蛋白-14
　　胎盘蛋白-14(placenta protein-14，PP-14，Glycodelin，PAEP)在3项研究中表达均上调，本研究中积水样本较正常样本、阻塞样本表达分别下调6.1、6.6，阻塞样本与正常样本表达无显著差异，PP-14最早是在胎盘中提取出来的，故命名为PP-14，但迄今尚无证据显示胎盘能合成这种蛋白，故又将其更名为Glycodelin，不同组织Glycodelin的糖基化形式不同，其功能也不同，末端包被有唾液酸化的LacNAC或LandNAC天线的寡糖系列能特异性的阻断细胞黏附及抑制由CD22(B细胞受体)介导的免疫活性，它们还能与凝集素样受体结合，阻碍该受体的信号转导作用，NK细胞和巨噬细胞就是通过凝集素样结合反应来识别异种细胞，因此Glycodelin可以抑制这两种细胞的免疫活性，由于E-选择素的岩藻糖化抗原也在Glycodelin上表达，所以Glycodelin通过这种有岩藻糖化天线结构的寡糖系列阻断E，选择素的连接位点而抑制细胞的黏附作用。Glycodelin对胚泡的成功植入及正常妊娠的维持有重要意义。
　　3．2．3　Dickkopfl
　　Dickkopfl(DKKl)在4项研究中表达均上调，本研究中积水样本较正常样本、阻塞样本表达分别下调3.5、3.9。阻塞样本与正常样本表达无显著差异，DKKl是一种分泌性糖蛋白质，与细胞膜上的Wnt受体LRP5(或LRP6)和DKKl共受体Kremenl(或Kremen2)结合，形成内吞小体，从而关闭Wnt信号通路，通过对Wnt信号转导途径的调控决定细胞的分化、增殖、极性、迁移和癌变等特性，在肿瘤的发生和胚胎的发育方面发挥重要作用，DKKl在人类子宫内膜分泌中期突发性地高表达，与着床窗的开启在时间上一致，提示DKKl可能是介导胚胎着床的关键因子之一，文献报道，DKKl在人胎盘中转灵活性增强，蛋白表达丰富，提示DKKl在胎盘构建，胚胎早期的分化发育中可能发挥一定的作用。
　　3．2．4 其它
　　衰变加速因子(DAF，CD55，)在4项研究中表达均上调，本研究中积水样本较正常样本、阻塞样本表达分别下调4.8、4.2，阻塞样本与正常样本无显著差异，DAF是一种重要的补体调节蛋白，因能加速C3转化酶的衰变而将其命名为衰变加速因子，在保护胎儿维持妊娠方面起重要作用。
　　单胺氧化酶A(MAOA)在4项研究中表达均上调，本研究中积水样本较正常样本、阻塞样本表达分别下调3.8、3.6，阻塞样本与正常样本无显著差异，人胎盘中MAOA活性较高，与去甲肾上腺素和肾上腺素的灭活有关，对维持妊娠起着重要作用。
　　DNA诱导损伤抑生长因子(GADD45A)在4项研究中表达均上调，本研究中积水样本较正常样本、阻塞样本表达分别下调3.2、3.4，阻塞 样本与正常样本无显著差异，GADD45基因可能在细胞周期控制、DNA损伤修复及细胞信号传导过程中有重要作用。
　　DNA结合抑制因子-4(ID4)在3项研究中表达均上调，本研究中积水样本较正常样本、阻塞样本表达分别下调2.5、2.4，阻塞样本与正常样本表达无显著差异，ID4具有抑制肿瘤细胞生长及促进细胞凋亡作用。
　　补体D(Adipsin，DF)在3项研究中表达均上调，本研究中积水样本较正常样本、阻塞样本表达分别下调2.4、2.9，阻塞样本与正常样本表达无显著差异，Adipsin由脂肪组织合成并分泌，是第一个从脂肪细胞系克隆的补体成分，在脂类代谢中起着重要作用。
　　嗅素相关蛋白-1(Olfactomedin related ERLocalized protein，OLFMl)在4项研究[2-5]中表达均下调。本研究中积水样本较正常样本表达上调2.3，积水样本与阻塞样本及阻塞样本与正常样本表达均无显著差异，OLFMl产物为分泌期糖蛋白，与发育相关，参与多器官发育，特别是神经系统的发育。
　　Msh同源盒1(MSXl)在3项研究中表达均下调，本研究中积水样本较正常样本表达上调2.8，积水样本与阻塞样本及阻塞样本与正常样本表达无显著差异，Msx基因是同源基因盒(homeobox)基因家族的成员，即Hoxa 7，表达于上皮组织中，其表达水平与上皮细胞的增生能力有关，下调该基因表达水平可以使基底细胞增殖能力下降。
　　大部分共同认定的植入窗期标志性基因在积水样本与正常样本、阻塞样本表达均有差异，且改变方向相反，说明输卵管积水患者子宫内膜容受性受到影响，可能导致其IVF时低妊娠率，但限于样本含量较小、研究对象个体差异、取材时间差异、使用基因芯片种类不同、结果分析软件不同及随机误差等造成基因芯片在子宫内膜容受性研究方面重复性、可比性差，子宫内膜容受性相关基因研究结果不一致，其重复性、再现�和可比性还有待进一步提高。此外，基因芯片技术筛查出的差异基因尚需进一步的生物学分析和机制研究。但是，随着基因芯片技术的不断成熟，很多问题能被逐渐解决，基因芯片技术作为一个技术平台必然给众多不孕症患者带来新的希望。
　　
　　作者简介：李艳萍(1962―)，女，湖南长沙人，中南大学湘雅医院教授，博士，通讯作者，主要从事辅助生殖临床工作及研究；赵红翠(1984―)，女，安徽铜陵人，硕士研究生，主要从事辅助生殖研究。