切割质粒的限制酶 [β分泌酶ＲＮＡ干扰质粒的构建与鉴定]

　　摘　要：选择人、小鼠和大鼠的BACE/基因的共有序列为干扰的靶标，设计4对干扰片段连接至带有GFP和U6 RNA聚合酶启动子的PRNATU6.1载体，将构建好的质粒转染HEK293T细胞，通过RT-PCR和westernblotting的方法分别在RNA和蛋白水平上来检测BACEl和Aβ，以鉴定其干扰效率，并通过夹心ELISA的方法进一步在过表达蛋白APP和BACEl的HEK293T细胞体系中验证干扰质粒对A6l一42生成的影响，RT-PCR和western blotting结果提示β分泌酶的siRNA能干扰BACEl和AJCI RNA和蛋白水平表达，效率分别达到90％和80％，Westerm blotting和ELISA结果提示，β分泌酶的siRNA也降低ABl-42生成。
　　关键词：Alzhcimer’s病；RNAi；β分泌酶；β淀粉样肽
　　中图分类号：Q189　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)03-0200-06
　　
　　在散发性AD病人大脑中，Aβ产物的增加与β分泌酶(Beta amyloid precursor protcin cleavingenzyme，BACEl)活性的增强呈现正相关，因BACEl是Aβ生成的限速酶，β分泌酶的表达具有组织特异性，主要在大脑和胰腺中表达，动物实验提示：痴呆组的海马和皮质部位BACEl表达显著性升高，下调BACEl的产生可减少Aβ产物的生成，降低Aβ产物的沉积，为AD的治疗开辟新的途径，RNA干扰(RNAi)技术作为一种在转录后水平有效降低基因表达的技术手段，具备抑制基因表达高效特异的特点，本实验利用这一技术，试图构建β分泌酶的干扰质粒，并在体外筛选有效的干扰质粒，为进一步在体研究奠定基础。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1．1　实验材料
　　克隆宿主菌E.coli Top10、HEK293T细胞，由本实验室保存，BACEl表达质粒由哈佛医学院Michale Farzan教授惠赠，APP表达质粒由东南大学窦非教授惠赠，pRNA-U6.1/Neo，购自Genescript公司，限制性内切酶与工具酶：BamH I，HindⅢ，Taq polymerase，T4 DNA Ligase均购自TaKaRa公司。
　　
　　1．2　实验方法
　　1．2．1　设计合成RNAi片段
　　根据NCBI上公布的Beta Amyloid CleavingEnzyme l(BACEl)的人类的4种不同变体的cDNA序列以及大鼠小鼠的序列，利用www.省略的在线设计程序根据保守区设计出4条RNA干扰序列siB1、siB2、siB3、siB4(图1)，并利用DNASTAR软件找到各自的互补序列，送交博采公司合成，合成的互补单链退火得到dsDNA。
　　1．2．2　干扰质粒的构建
　　本方案选用了pRNAT-U6.1/Neo作为RNAi的载体，pRNAT-U6.1/Neo经BamH I、HindⅢ酶切得到目的载体片段，将博采公司合成的dsDNA与pRNA7-U6.1/Neo载体片段连接构建重组质粒，载体带有GFP表达系统。
　　
　　1．2．3　连接产物转化Top10转化感受态细胞(Amoieillin抗性)
　　连接产物转化Top10感受态细菌扩增Ampicillin平板筛选并纯化重组质粒载体pRNAT-si BACEl，得到pRNAT-siBACE1-1(siB1)，pRNAT-si BACE1-2(siB2)，pRNAT-si BACE1-3(siB3)，pRNAT-si BACEl-4(siB4)。
　　1．2．4　阳性克隆PCR鉴定
　　针对载体和插入片段分别设计上下游引物，PCR引物大致位置见图1，序列见表1，直接取菌落些许加入PCR体系进行鉴定，其他小量培养，PCR产物电泳，根据条带的有无，直接可判断阳性，对应的阳性菌落进行小量培养，保种和测序，大连TAKARA公司测序引物为T7promoter，测序结果证实得到的干扰质粒序列正确，碱裂解法大提重组质粒siB1、siB2、siB3、siB4。
　　
　　1．2．5　干扰效果检测实验
　　1．2．5．1　Lipofectamine2000(Invitrogen)转染 干扰质粒siB1、siB2、siB3、siB4通过脂质体的方法瞬时转染到293T细胞，用表2、表3内的质粒量分别作了内源性和过表达的干扰试验，每孔对应3个重复。
　　
　　1．2．5．2　RT-PCR鉴定干扰效果
　　转染后的HEK293T细胞，用于rizol(Invitreogen)-Phenol-Chloroform三步法抽提RNA后逆转录得到cDNA，然后分别用针对GAPDH和BACEl设计的引物进行扩增，1％琼脂糖凝胶进行电泳。
　　1．2．5．3　Western blotting鉴定干扰效果
　　转染后的293T细胞裂解后，取上清进行蛋白定量(Bradford法)，各样品取50μg的蛋白量加样到10％SDS-PAGE蛋白电泳；电转移蛋白质到硝酸纤维素滤膜电转电流0.1mA/cm2，时间3h；5％脱脂奶粉封闭非特异性结合位点；弃去封闭液，用PBST洗涤；把膜置于塑料袋中，加入1mL的鼠源APP单抗(MAB348，Chemicon，1:200)或鼠源BACEl单抗(Mab5308,Chemicon，1:1000)或鼠源AB单抗(4G8,44-356，Biosource，1:1000)；PBST洗膜后加入1mL(0.1mL/cm2)1:2000兔抗鼠IgG-HRP抗体；PBST洗膜；ECL plus Western BlottingDetection System试剂盒检测蛋白表达水平。
　　1．2．5．4　夹心ELISA测定Aβ表达量
　　在过表达蛋白APP和蛋白BACEl的RNA干扰转染实验中，吸取转染APP表达质粒和BACEl表达质粒48h后的细胞培养上清，用夹心ELISA检测A/Cz的含量，酶标仪中450nm下读取光密度，计算标准液，对照样品的平均光密度，用标准液光密度对标准液浓度在一个半对数表上作图得到一个标准曲线，通过标准曲线算出每个未知浓度。
　　
　　2　实验结果
　　
　　2．1　阳性克隆PCR鉴定结果
　　
　　每个干扰质粒对应的阳性克隆挑取3个用菌 落PCR鉴定，结果显示(图2)，PCR产物的大小均在1200bp左右，与理论值一致，挑取的12个克隆全部为阳性。
　　
　　2．2　RT-PCR鉴定结果
　　为了验证干扰质粒在RNA水平上的干扰效果，我们将干扰质粒转染至HEK293T细胞48h后，提取RNA，以空的干扰载体(pRNAT-U6.1/Neo)为对照组，结果表明转染效率达90％以上(图3)，RT-PCR产物电泳后对条带进行灰度扫描，计算干扰条带与相应内参条带的灰度比值，结果显示干扰质粒siB2和质粒siB4的干扰BACEl效果较好(图4)，构建的siB2和siB4质粒明显干扰HEK293T细胞中内源性BACEl RNA表达，其中siB4的干扰效果最好，与对照组相比，可达到90％以上。
　　　
　　2．3　Western blotting鉴定结果
　　由于存在一些在RNA水平上有干扰效果但是蛋白水平干扰不佳的现象，所以我们用Westernblotting的方法进一步验证了干扰质粒在蛋白水平上的干扰效果，所得条带进行灰度扫描，计算干扰条带与相应内参条带的灰度比值，结果与RNA水平上的验证结果一致(图5)，仍然是siB4的干扰效果最好，与对照组相比，干扰效果达到80％以上，siB2其次。
　　
　　2．4　高表达APP及BACEl的HEK293T细胞中的干扰效果
　　HEK293T细胞中内源性APP和BACEl蛋白含量较少，在以上的实验中，我们蛋白上样量超过100μg，才能检测到干扰细胞内源性BACEl表达效果，但很难检测到BACEl切割APP后产生的β－淀粉样蛋白。
　　为了进一步验证我们的干扰质粒子扰BACEl后也能降低下游产物β－淀粉样蛋白的产生，我们在HEK2937细胞中共转染了APP及BACEl两个表达质粒，同时转染不同浓度的干扰效果最好的siB4质粒以及对照质粒siB1，根据转染质粒数量的不同可分为两组：siB11.0和siB41.0为一组，分别转有质粒siB1和siB4各1.0μg；siB11.5和siB41.5为另一组，分别转有质粒siB1和siB4各1.5μg，选取siB1作为siB4的对照质粒原因在于：一方面由于siB1干扰效果不佳，另一方面siB1与siB4在序列上仅相差4个碱基(见2.1设计合成RNAi片段)，它们干扰序列设计的位点所在的位置在BACEl对应RNA序列上仅相差一个碱基。
　　共转染48h后，收取细胞用Western blotting的方法检测了细胞中APP、BACEl的表达情况，夹心ELISA的方法检测细胞培养上清中AB的变化，结果显示(图6)：对照质粒siB1和干扰质粒siB4的细胞BACEl蛋白的表达均有不同程度的下降，且随干扰质粒剂量的升高BACEl表达量逐渐降低；siB4干扰效果明显强于siBl，细胞中和培养上清中的Aβ的含量均随干扰质粒浓度升高而下调，在干扰质粒浓度达到1.5g/500 L培养基时，与对照组相比效果尤为明显(p＜0.05)。
　　
　　3　讨论
　　
　　本实验中利用RNA干扰技术，以HEK293T细胞为平台，验证了BACEl的有效干扰质粒，无论是干扰内源性的BACEl RNA还是外源性的BACEl表达质粒都取得了良好的干扰效果，而且在体外验证了干扰之后下游Aβ分子的产生情况，干扰效果呈剂量依赖性，与国内外同类研究中干扰BACEl后得到的结果相一致。
　　AD发生的淀粉样蛋白偶联假说认为，AD的基本病理过程是APP经BACEl和γ分泌酶的次序性降解，引起毒性片断CTF(C TerminalFragments)和Aβ在神经细胞外积聚，作为“晶核”引发斑块形成，所以降低APP、BACEl或γ分泌酶的表达以及活性可减少CTF和Aβ的生成，这可成为一种可靠的治疗策略，由于γ分泌酶的组成很复杂，包括众多分子构成而且还参与其他重要的神经信号转导途径，如与发育密切相关的Notch信号通路，因此抑制γ分泌酶的表达将会产生负效应，与丫分泌酶相比，BACEl较专一，除此之外，BACEl基因缺失的小鼠没有表现出神经异常，并且可以阻止Aβ的产生，避免老年斑的形成，而APP的表达，一方面没有什么特异性，另一方面在其他部位尚发挥重要作用，所以BACEl是目前已知的最好的可用于干扰治疗老年痴呆的分子靶标之一。
　　BACEl作为老年性痴呆的重要药物靶点，采用RNA干扰的方法克服了小分子抑制剂抑制效率低、特异性差的不足，为老年性痴呆的临床治疗增添了新的治疗手段，当然，RNA干扰用于老年性痴呆的临床治疗还需要走很长的路，还需要解决很多问题，如RNA干扰导入神经元细胞并能否持久表达等等。
　　本研究不仅在细胞水平上进行了BACEl的内源性干扰实验，而且针对神经元内BACEl、APP高表达的情况检验了其干扰效果，不仅用Western blotting的方法定量分析了Aβ的总体变化，而且用夹心ELISA的方法确定了产物A131-42的改变，利用带有GFP的干扰质粒更好的控制了转染效率，提高了实验的可信度。
　　体外的BACEl干扰实验验证了干扰质粒的良好干扰效果，前期细胞模型实验为后续的动物模型实验做好了充分的准备工作，也为检测、发现痴呆中相关基因的功能以及痴呆的基因治疗做好了铺垫，目前正在进行的工作是：把干扰效果良好的干扰序列构建入慢病毒(Lentivirus)载体，体外包装病毒颗粒后感染原代培养神经元以及模型动物，进一步探讨AD相关基因的功能，为以后的基因治疗奠定基础。
　　
　　作者简介：潘岩(1981－)，男，河南南阳人，南京大学硕士研究生，从事分子生物学研究；徐运(1961－)，女，江苏扬州人，南京大学教授，神经科主任，主任医师，博士生导师，通讯作者，主要从事痴呆和脑血管病的基础和临床研究。