Ｈ９ｃ２心肌细胞多巴胺受体的表达|多巴胺受体激动剂有哪些
黄建军 刘洪波 徐 霞 张捷平 刘辰庚 肖敬川 宋惠萍 摘要：为明确H9c2心肌细胞是否能够表达多巴胺受体(dopamine receptor,DR)，应用RT-PCR和Western blot-ting分别检测H9c2心肌细胞和SD成年雌鼠左心室心肌组织中，DR的两种亚型，D1DR和D4DR的表达，结果发现，H9c2心肌细胞可在mRNA和蛋白水平上表达出与SD大鼠心肌组织相同的产物，这说明能以H9c2心肌细胞为研究材料，进一步深入研究心肌DlDR和D4DR基因的表达调控机制以及心肌DR的功能。
关键词：多巴胺受体；心肌细胞；表达
中图分类号：R34
文献标识码：A
文章编号：1007-7847(2007)02-0139-04
多巴胺受体(dopamine receptor，DR)为7次跨膜的G蛋白偶联受体超家族的成员，属于视紫红质类家族，目前已分离出5种DR，根据生化和药理学特性，可分为D1样和D2样受体，Dl样受体包括D1DR和D5DR两种亚型，可激活腺苷酸-环化酶－cAMP-蛋白激酶A途径；D2样受体包括D2DR、D3DR、D4DR 3种亚型，与D1样受体的作用相反，抑制上述信息途径的活化，DR广泛分布于中枢神经系统及外周多种组织，如人和大鼠心肌及冠脉均已检测到DR的表达，据本室研究报道，与假手术组比较，去势大鼠心肌D1DR和D4DR的转录表达水平发生显著改变，本研究拟采用RT-PCR和Western blotting技术，检测大鼠心肌细胞系H9c2和SD大鼠左心室心肌组织内，D1DR和D4DR的mRNA和蛋白的表达。
1材料与方法
1.1材料
大鼠胚胎心脏来源的细胞株H9c2购自American type culture collection公司，DMEM培养液、胎牛血清购自GIBCO公司，青链霉素购自Sigma公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，AMV逆转录试剂盒购自Promega公司，兔抗大鼠D4DR多克隆抗体购自Calbiochem公司，羊抗大鼠D1DR多克隆抗体、抗actin抗体以及HRP-标记的二抗均购自Santa cruz公司，Ecl WesternBlotting检测试剂盒购自Amersham公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养
大鼠心肌细胞H9c2培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃，5％CO2的条件下培养，待细胞生长至90％单层时传代。
1.2.2 RT-PCR
应用Trizol试剂提取SD雌鼠心肌和H9c2细胞总RNA，依A260和A280数据判断RNA的纯度及含量，两步RT-PCR法扩增靶序列，按逆转录常规方法合成cDNA第一链，反应体系包括经脱氧核糖核酸酶(DNase)处理过的总RNA 1μg，Oligo(dT)161μL，5×逆转录反应缓冲液4μL，RNA酶抑制剂1μL，dNTP(10mmol/L)2μL，AMV逆转录酶200u，于42℃反应60rain，70℃，10min终止反应，-20℃保存备用，取1μLcDNA为模板进行PCR扩增，条件为：10mmol/LTris-HCl(pH8.3)，50mmol/LKCl，1.5 mmol/LMgCl2，dNTP200μmol/L，引物0.5μmol/L，0.025U/μLTaqDNA聚合酶，D4DR上游引物为5′-ac-、cetactcagggtcccctct-3′，下游引物5′-gatcttggcgc-ctctctnc-3′；D1DR上游引物为5′-agatgacccc-caaagcag-3′，下游引物5′-acgtectgctcaaccttg-3′；同时选用GAPDH作为内标，GAPDH上游引物为5′-accacagtccatgceatcac-3′，下游引物5′，tccaccaccct-gttgctgt-3′，PCR反应条件为：94℃5 min：94℃30s，退火30s，72℃1min20s，33个循环：72℃10min，反应结束后取20PCR产物，1.5％琼脂糖80V电泳20min，凝胶成像系统照像。
1.2.3心肌组织和H9c2细胞总蛋白的提取和蛋白质免疫印迹检测
取成年大鼠左心室样品，液氮内研磨，加入全细胞裂解液，冰上处理30rain，4℃12000g离心15min，取上清采用Bradford法进行蛋白质定量，细胞总蛋白的提取为直接在细胞培养瓶内加入细胞裂解液后，处理同上，取50μg总蛋白样品于，10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转印至硝酸纤维素膜，用10％无脂牛奶37℃封闭1h，抗D1DR抗体(Santa，1：500)或抗D4DR抗体(calbiochem，1：500)4℃孵育过夜，TBST(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris・Cl，pH为7.5.1mL/L Tween-20)洗膜4次，再用辣根过氧化物酶一标记2抗(1：4000)室温孵育1h，TBST洗涤15min×4次，ECL化学发光法曝光显影。
2结果
2.1心肌组织和H9e2细胞的DR基因的RT・PCR
由琼脂糖凝胶电泳图(图1)可见，从心肌组织和H9c2细胞中均可扩增出D1DR、D4DR和GAPDH基因的RT-PCR产物，片段长度分别为183、191、433 bp，为预期大小的PCR产物条带，未加逆转录酶的PCR结果为阴性，表明扩增产物来自cDNA而不是来自基因组DNA(见图1)。
2.2心肌组织和H9c2细胞D1DR和D4DR的Western blotting检测
如图2所示，在H9c2细胞样品中，均可检测到D1DR、D4DR以及GAPDH的蛋白区带，其区带位置和相对分子质量大小与心肌组织中相应的蛋白表达产物一致。
3讨论
来用RT-PCR和Western blotting技术，本研究首次报道了D1DR和D4DR在H9e2细胞中的表达，我们也检测到SD大鼠心肌中D1DR的表达，这与以往对Wistar-Kyoto大鼠或／和自发性高血压大鼠心肌中D1DR表达的报道一致，另外尽管Ricci A等采用特异性的放射性配基结合实验和放射自显影技术，在大鼠的心室和心房中已间接检测到D4DR的存在；而本研究则从mRNA水平和蛋白质水平上，直接证明了大鼠心肌组织中D4DR的表达。
目前已在心肌组织检测到多种DR亚型，如D1DR，D2DR，D3DR和D4DRtS等，但是人们对心肌DR的功能认识不足，据现有的研究，多巴胺灌注缺血心肌能提高心肌收缩性，提高细胞溶胶内钙离子浓度，引发线粒体钙超载，导致心肌细胞凋亡，选择性D3激动剂(+/-)-7-OH-DPAT和D4激动剂PD168077(10-9～10-5mol/L)可诱导荷兰猪心脏样品产生明显的负性变时作用和负性变力作用，最近国内徐长庆等在对Wistar雄鼠的研究中发现，心肌D1DR和D2DR的表达水平与心肌肥厚之间存在一定的对应关系，这些研究提示DR在心脏具有一定的功能。
心肌组织包括心肌细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞等多种细胞类型，其中心肌细胞虽然大概只有心肌组织细胞总数的1/3，但大约占到心脏总体积的75％左右，心肌细胞更是心肌兴奋性、自律性、传导性和收缩性的结构和功能基础，目前虽然原代培养心肌细胞被广泛应用，但普遍认为大鼠心肌细胞在出生后3d内只具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力，本课题组使用的H9c2心肌细胞是来源于大鼠胚胎的心肌细胞，其优良的分裂能力可提供大量的细胞，克服原代培养细胞数量不足的局限，因而It9c2心肌细胞被越来越多地用于心血管研究领域。
本课题组通过RT-PCR和Western blotting技术，发现心肌细胞H9c2和大鼠心肌组织一样，可表达D1DR和D4DR，因此我们认为可利用该细胞株深入研究雌激素对多巴胺受体基因表达的调控机制，该细胞株也可用于研究多巴胺受体对心肌功能的影响。