ｎｍ２３－Ｈ１基因转染Ｌ９９８１肺癌细胞前后基因表达谱的变化_途观L

　　摘 要：应用基因芯片检测L9981细胞转染nm23-H1基因前后细胞基因表达谱的改变。提取L9981细胞转染nm23-H1基因前后细胞的总RNA，纯化为mRNA后再转录为cDNA。cDNA经限制性内切酶Sau3AI消化后，cDNA片段分别用cy3和cy5标记， 与定制的包含14000个基因芯片杂交。杂交结果经扫描和软件分析，nm23-H1基因转染L9981细胞后发现1156(8．26％，1156/14 000)个基因表达上调，而642(4．59％，642／14000)个基因表达下调。涉及基因包括信号传导、癌基因与抑癌基因、转移相关基因、细胞周期与凋亡、细胞外基质与细胞骨架相关基因， 以及细胞因子和转录因子等。nm23-H1基因是通过对转移相关基因的调节来发挥其抑制肺癌细胞株L9981侵袭和转移作用的。
　　关键词：L9981；基因芯片；基因表达；nm23-H1基因
　　中图分类号：R734．2；Q813．1
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007―7847(2006)01―0077―05
　　nm23-H1基因已被证明是肿瘤转移抑制基因。 将nm23-H1基因的cDNA转入nm23-H1基因表 达缺失的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981，可 以逆转其恶性表型。但是nm23-H1抑制肺癌侵 袭与转移的分子机制尚不十分清楚，我们以往的 研究表明，nm23-H1基因抑制肿瘤侵袭与转移可 能是通过对转移相关基因的调控实现的，为进 一步研究nm23-H1作用的分子机制，我们应用基 因芯片检测了nm23-Hl转染L9981前后相关基因 表达的变化。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1．1 材料
　　l，1．1 细胞株
　　1)L9981(高转移大细胞肺癌细胞株)；2) L9981－nm23-H1(稳定表达nm23-H1基因的 L9981细胞株)。均由四川大学华西医院四川省 肺癌分子重点实验室提供。
　　
　　1．1．2 常用试剂及设备
　　精制小牛血清和RPMI t640培养基购自Hy－ clone公司；用120mmol／L的NaOH溶液配成l mmol／L的贮备液，4℃贮存。SuperScriptTM II RNase H- Reverse Transcriptase(1nvitrogen Cat．No．18064-014)，dATP、dGTP、dCTP、 dTYPOligod(T) Primer(Bioasia合成)，Cy5 (Amersham，Cat，No．PA55021)，Cy3(Amersham， Cat．No．PA53021)， RNA inhibito(Takara， Cat．No．D2311A)，OlAquick Nucleotide Removal Kit(OIAGEN，Cat，No．28306)Genemachine：型号 OmniGrid 100Pixsys5500芯片打印仅购自Carte― sian公司，ScanArrayLite芯片扫描仪及其分析软 件Quantarray购自GsiLumonics公司，玻片及芯 片杂交盒购自Coming公司。
　　
　　1．1．3 基因芯片
　　项目所用芯片版本号为2．2人cDNA基因表 达谱芯片，产品目录号为SBC-R-HC-100-22．芯片 编号为17874，17873(上海生物芯片工程公司)。
　　
　　1．2 方法
　　1．2．1 总RNA的纯化
　　(RNeasy　Mini Kit)应用QIAGEN RNeasy Kit纯化总RNA，详细操作原理和方法见RNeasy Mini Protoc01。
　　
　　1，2，2 总RNA质量检测
　　(Labonchip检测)具体操作步骤参考人cD- NA表达谱芯片使用手册，SBC-H―HC-100-22，具 体结果见《样品质检报告》。Lab-on-chip参照Agi- lent 2100分析仪操作手册，制备凝胶，按照软件 提示进行RNA电泳操作，评价RNA质量。
　　
　　1．2．3 样品制备
　　cDNA用Sau3Al酶切后接上接头，之后用 PCR通用引物扩增。PCR产物经PCR产物纯化 试剂盒纯化后取出500 ng。实验标记方法采用 cDNA直接标记法，其中实验组RNA (L9981－nm23-H1)采用cy3荧光标记，对照组 RNA(L9981)RNA采用荧光cy5标记。加入Cy3／ Cy5标记的引物(100 lLm01／L)21lL(NaOH作用 的对照组用Cy5标记，As20，作用的处理组用Cy3 标记)，同样条件再行PCR扩增和纯化，将PCR产 物终浓度调至200mg／L。
　　
　　1，2．4 杂交
　　标记后的样品95℃变性后加到经预杂交的 芯片阵列表面，轻轻覆上盖玻片，放人杂交盒内， 42℃杂交18h。
　　
　　1．2．5 检测与分析
　　芯片结果采用Agilent扫描仪进行扫描，Ima- gene软件读取数据Scan resolution 10μm，PMT 100％，最后采用Genespring进行Normalize处理 分析，最后ratio值为cy3／cy5，即实验组／对照组． 差异基因筛选标准：(1)ratio>或=2为上调基因， ratio喊=0．5为下调基因。
　　
　　1．3 统计学分析
　　聚类分析法。应用genespring和cluster分析 软件进行聚类分析。
　　
　　2 结果
　　
　　2．1 细胞的总RNA电泳图
　　两株细胞(L9981，nm23―H1和L9981)总RNA 抽提纯化后，1％的琼脂糖凝胶电泳可以看到明显 的28、18、5S条带，并且28S的条带明显亮于18 S带；70℃水浴保温1h后的电泳图与水浴前的 电泳图无明显差异，证明所提取的总RNA质量及 完整性均很好(图1)。
　　
　　2．2 基因芯片杂交结果和分析
　　再将Cy5和Cy3的扫描图像完全重叠，得到 的杂交图中(图2)，红色点表示低表达，绿色点表 示高表达，黄色点表示表达水平无改变。图经软 件分析后，得到芯片杂交的散点图(图3)。每个点 的Y轴表示Cy3的杂交信号的相对强度，X轴表 示Cy5杂交信号的相对强度。45°角直线(实线所 示)上的点Cy5／Cy3的比率为l，表示无差异表 达，远离45°角直线的点为差异表达，离的越远， 表示差异越大，落在2条虚线以外的点即是 Cy3／Cy5的比率大于2或小于0．5的点。
　　
　　2.3 基因芯片筛选结果
　　nm23-H1基因转染L9981细胞前后差异表 达基因共l792条，其中基因表达增加(上调)为 1156条，表达减少(下调)为642条．在表达上调 的基因中有未知功能的基因1035条，而功能清楚 的基因121条，其中包括：细胞周期与凋亡基因31 条、癌基因0条，抑癌基因18条、转移相关基因12 条，细胞因子与转录因子13条，细胞信号与蛋白相 关基因38条，细胞外基质与骨架蛋白9条，在表达 下调的基因中有541条功能不明的基因，而已知基 因有101条，其中包括：细胞周期与凋亡基因12 条、癌基因11条，抑癌基因3条、转移相关基因 14条，细胞因子与转录因子21条，细胞信号与蛋 白相关基因27条，细胞外基质与骨架蛋白13条 (见表1)。
　　
　　3 讨论
　　
　　nm23-H1基因是肿瘤转移抑制基因，它的低 表达和缺失与肺癌的侵袭和转移密切相关．我们 的前期研究发现nm23―HI基因蛋白和mBNA低 表达、突变，等位基因缺失与肺癌的高转移性和预 后不良有密切关系。具有高转移潜能的人高转 移大细胞肺癌L9981细胞中存在nm23-HI等位 基因的杂合性缺失，L9981细胞在体外具有较强 的克隆形成能力和侵袭力，在裸鼠体内的自发性 肺转移能力为100％。以往的研究表明将 nm23-HI基因导入L9981细胞株可以逆转其恶 性表型，表现为体外增殖能力，克隆形成能力，侵 袭力，和自发性裸鼠肺转移能力显著降低。周 清华等的研究发现伴有nm23-H1基因缺失的肺 癌常伴有一些肿瘤侵袭相关分子的表达异常，并 推测nm23-H1基因可能为“肺癌转移抑制级联” 相关基因的上游调节基因，它对肿瘤转移潜能的 抑制作用是通过调控下游基因实现的。但是 nm23-HI基因逆转肺癌恶性表型的分子机制尚 不清楚。
　　利用基因芯片技术为我们研究nm23-H1基 因结构和功能的变化对肺癌侵袭和转移的分子机 制提供理想的技术支持，基因表达谱芯片具有高 通量、大规模、快速高效和灵敏度高的特点，可以 分析两组或两组以上不同来源的mRNA丰度的 差异，通过计算杂交信号的比值和统计分析，可以 获得差异表达基因信息。
　　本实验利用肿瘤基因表达谱芯片分析 nm23-H1基因转染L9981细胞前后相关基因的 表达改变，基因表达谱芯片的应用为研究 nm23-H1基因作用的分子机制提供了相关基因 的基因组学证据，突破了以往单个基因孤立研究 的局限，特别是采用将外源基因导入不表达该基 因的细胞，避免了标本取样的组织学差异，使实验 结果数据更加可靠，更加便于分析，本研究应用 包含14 000种基因的SBC-R-HC-100-22cDNA基 因表达谱芯片，对L9981细胞转染nm23-Hl基因 前后进行分析，通过比较两者基因表达的差异信 息，寻找与nm23-H1基因表达相关的基因，本研 究共筛选出差异表达基因1792个，转染 nm23-Hl基因后，基因表达上调的基因有1156 条，其中有1035条基因的功能不清楚，而已知基 因有121条；而基因表达下调的基因有642条，其 中有541条是未知基因，101条是功能清楚的基 因．在上调和下调的已知基因中包括：细胞周期 与凋亡基因、癌基因，抑癌基因、转移相关基因，细 胞因子与转录因于，细胞信号与蛋白相关基因，细 胞外基质与骨架蛋白。在表达上调的基因中有较 多是与肿瘤的转移相关的基因，主要有E-Cad、 beta-catenin、nm23和TIMP-1、2等，而表达下调 的与肿瘤转移相关的基因主要有：Ras、VEGF、 PDGF-A、Erk-／、2、c-src等。这些研究结果与我 们以往的研究结果一致。
　　但是本研究也发现nm23-H1基因的高表达 也可以使一些抑癌基因高表达、细胞因子和转录 因子的活性增强，提高细胞外基质酶的活性，影响 细胞骨架蛋白的合成。因此可以推测nm23-H1 基因可以通过多种途径抑制肿瘤细胞的侵袭与转 移，如通过对细胞周期和凋亡相关基因的调控抑 制细胞的增殖能力和克隆形成率，降低基质金属 蛋白酶的活性，抑制促进血管生成基因的表达，进 而抑制肿瘤的侵袭与转移。由此可见，nm23-Hl 基因对L9981细胞恶性表型的逆转是通过对下游 相关基因的调控实现的，并且是“肺癌转移抑制级 联”中的正向调控的关键基因和上游基因。
　　总之，肿瘤的侵袭和转移是多基因、多因子共 同作用的结果，并且是一至两个关键基因在时间 上和空间上相互配合，协同促进了细胞的癌变、侵 袭和转移。因此，在研究肿瘤侵袭与转移的分子 机制时，也应进行多基因的分析，而不只是局限 在几个单一基因上，基因芯片为研究肿瘤的发 生、发展及基因之间的相互作用提供了有力的研 究工具。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文