【C3和C4植物中PEPC的生物信息学分析】C3与C4植物的主要区别
摘要：ＰＥＰＣ是Ｃ４光合途径中的关键酶之一，为研究Ｃ３和Ｃ４植物ＰＥＰＣ功能上的差异，利用一系列的生物信息学软件分别分析了４种Ｃ３和Ｃ４植物ＰＥＰＣ基因编码蛋白的氨基酸组成、等电点、结构域、二级结构、空间结构等性质，并进行两类植物蛋白质的比对。结果表明，ＰＥＰＣ基因编码蛋白为不稳定蛋白质；二级结构主要是以无规则卷曲为主。同时揭示出Ｃ３和Ｃ４植物ＰＥＰＣ存在一定差异。用ＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ的建模服务器进行ＰＥＰＣ结构的三维建模，预测得到一个同源性较高的蛋白质结构数据１ＪＱＯ ｃｈａｉｎ Ａ，同源性为９９．７％，从而构建目标序列的三级结构。利用ＰＲＯＣＨＥＣＫ对建模结果进行检测，模拟得到的玉米ＰＥＰＣ蛋白质的三维结构的氨基酸残基有９４．２％位于Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ点图中合理区域，模拟得到的玉米ＰＥＰＣ的三维结构是可靠的。
关键词：Ｃ３植物；Ｃ４植物；ＰＥＰＣ；生物信息学
中图分类号：Ｑ９４５．１１；Ｑ６１７文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）12－2558-05
Bioinformatic Analysis of PEPC in C3 and C4 Plants
ＷＵ Ｍｅｉ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｂｉａｎ－ｊｉａｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｐｉｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｒｏｎｇ－ｆｕ２，ＣＨＥＮ Ｑｕａｎ－ｚｈａｎ１
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｘｉａｏｚｈｕａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１１７１，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃ３ ａｎｄ Ｃ４ ＰＥＰＣ， ＰＥＰＣ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｃ３ ａｎｄ Ｃ４ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｖａｒｉｏｕｓ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ｔｏｏｌｓ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｓｕｃｈ ａｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ， pＩ， ｄｏｍａｉｎｓ， ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｄ ｓｐａｔｉａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ； ａｎｄ ｔｈｅ ＰＥＰＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃ３ ａｎｄ Ｃ４ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｌｉｇｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＰＥＰＣ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｕｎｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｍａｉｎｌｙ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｓｏｍｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＰＥＰＣｓ ｏｆ Ｃ３ ａｎｄ Ｃ４ ｐｌａｎｔｓ． Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ（９９．７％） ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄａｔａ １ＪＱＯ ｃｈａｉｎ Ａ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ＰＥＰＣ ｂｙ ＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ， ｔｈｕｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｔｈｅ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｔｈｅ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｚｅａ ｍａｙｓ ＰＥＰＣ was ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｈｅｃｋｅｄ ｂｙ ＰＲＯＣＨＥＣＫ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒ， ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ９４．２％ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ were ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｆａｖｏｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｐｌｏｔ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｚｅａ ｍａｙｓ ＰＥＰＣ ｗａｓ ｒｅｌｉａｂｌｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃ３ ｐｌａｎｔ； Ｃ４ ｐｌａｎｔ； ＰＥＰＣ； ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
与Ｃ３植物相比，Ｃ４植物具有光合效率高、ＣＯ２补偿点低、几乎没有光呼吸等优点，特别在强光、高温、干旱等条件下，Ｃ４植物具有明显的生长优势及较高的水分和营养利用率，生物学产量也较高［１］。Ｃ４途径包含多种酶类如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＰＥＰＣ）、ＮＡＤＰ－苹果酸脱氢酶（ＮＡＤＰ－ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＮＡＤＰ－ＭＤＨ）、ＮＡＤＰ－苹果酸酶（ＮＡＤＰ－ｍａｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅ，ＮＡＤＰ－ＭＥ）和丙酮酸磷酸二激酶（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｏｒｔｈｏ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ，ＰＰＤＫ）等，这些酶有效地固定外部及其光呼吸释放的ＣＯ２［２］从而使加氧酶活性受到抑制，降低了氮素的消耗，提高了水分利用率，大大提高了光合生产力［３］。近年来与光合作用途径相关的关键酶的基因已分别从玉米、高粱和苋菜等Ｃ４植物中被克隆，并开展了Ｃ４基因的遗传转化工作［４］。值得注意的是，Ｋｕ等［５］首次成功地将玉米Ｃ４光合途径的关键酶ＰＥＰＣ基因导入Ｃ３作物水稻中，获得了高表达的转基因水稻株，有效地提高了ＰＥＰＣ活性。罗素兰等［６］和张桂芳等［７］分别克隆了Ｃ４植物甘蔗和稗草ＰＥＰＣ基因并进行了功能验证。Ｃｈｅｎ等［８］又成功地将玉米Ｃ４型ＰＥＰＣ基因导入小麦中并实现有效表达，展示了转光合关键酶ＰＥＰＣ基因改造Ｃ３作物的应用前景。
Ｈｅｒｍａｎｓ［９］在菊科黄花菊属（Ｆｌａｖｅｒｉａ）中发现ＰＥＰＣ有Ｃ３型、类似Ｃ３型、类似Ｃ４型、Ｃ３－Ｃ４中间型、Ｃ４型等不同代谢类型，分析它们的ＰＥＰＣ基因，发现同源性极高，Ｃ４植物ＰＥＰＣ基因与Ｃ３植物ＰＥＰＣ基因有７１％的同源性，由于表达量不同而活性高低不同。前人的研究表明玉米的ＰＥＰＣ有Ｃ４型、Ｃ３型和根型３种类型［１０］；高粱的ＰＥＰＣ基因家族有３个成员ＣＰ２１、ＣＰ２８、ＣＰ４６［１１］；Ｆｌａｖｅｒｉａ的ＰＥＰＣ基因家族由ｐｐｃＡ、ｐｐｃＢ和ｐｐｃＣ ３个亚家族组成［１２］。尽管ＰＥＰＣ也是Ｃ３植物中另一主要羧化酶，为三羧酸循环补充草酰乙酸起回补反应的功能，但以Ｃ３植物的形态结构，ＰＥＰＣ还不能完成ＣＯ２净固定直接生成碳水化合物，因为三羧酸循环的碳与ＰＥＰC结合是一种损失，必须在ＣＯ２固定后再进入Ｃａｌｖｉｎ循环。而在Ｃ４和ＣＡＭ植物中，ＰＥＰＣ介导β羧化反应，把ＣＯ２固定为草酰乙酸，后转变为四碳酸［１３］。在结构上除了Ｎ端有调节磷酸化的基团外，来源于不同生物的ＰＥＰＣ其反应机制本质上是相同的［１４］。但不同来源的ＰＥＰＣ在不同植物体内有着不同的生化和生理特性，并致使光合作用产生较大的差异。通过对ＰＥＰＣ进行生物信息学的分析，来进行基因的结构和功能的比较，预测产生的结构和功能的差异，以期为将Ｃ４关键酶转入Ｃ３作物或者通过修饰Ｃ３作物的基因来改造Ｃ３作物，从而有效提高作物的光合生产力。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 １材料与方法
１．１供试材料
数据资料来源于Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）核酸及蛋白质数据库中已注册的核酸序列及对应的氨基酸序列：玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ，ＡＪ５３６６２９）；稗草（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｃｒｕｓ－ｇａｌｌｉ，ＡＹ９９５２１２）；甘蔗（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ，ＡＪ２９３３４６）；高粱（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ，ＸＭ＿００２４３８４７６）；拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ，ＡＹ２１０８９５）；水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ，ＡＦ２７１９９５）；棉花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ，ＥＵ０３２３２８）；大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ，ＡＢ００８５４０）。
１．２试验方法
利用生物信息学数据库和互联网上的软件进行分析，用Ｐｒｏｔｐａｒａｍ［１５］分析ＰＥＰＣ基因编码蛋白的氨基酸序列组成、分子量、等电点等理化性质；在ＮＣＢＩ［１６］上对其保守结构域进行分析；用ＳＯＰＭＡ［１７］预测其二级结构；用ＰＲＯＳＩＴＥ［１８］分析蛋白质功能；以ＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ［１９］程序预测三级结构；利用检测蛋白质质量结构的软件ＰＲＯＣＨＥＣＫ［２０，２１］对预测的蛋白质三维结构进行分析。
２结果与分析
２．１ＰＥＰＣ一级结构分析
２．１．１ＰＥＰＣ理化性质分析用Ｐｒｏｔｐａｒａｍ预测ＰＥＰＣ基因编码的蛋白质的理化性质［１５］。这８种植物ＰＥＰＣ的理论推导半衰期为３０ ｈ（体外，哺乳动物的网织红细胞内）；大于２０ ｈ（体内，酵母细胞内）；大于１０ ｈ（体内，大肠杆菌）。Ｃ４植物总的带负电残基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）和总的带正电残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）略低于Ｃ３植物，总的亲水性平均系数（ＧＲＡＶＹ）平均略高于Ｃ３植物，为－０．４５～－０．３０，预测该蛋白质属于亲水性蛋白质。Ｃ４植物不稳定参数低于Ｃ３植物，但两者均为不稳定蛋白质。８种植物ＰＥＰＣ蛋白质中含量较多的氨基酸基本相同，为Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ａｌａ。其中排第三和第四的Ａｒｇ和Ａｌａ的含量略有不同，在Ｃ４植物中排第五的为Ｇｌｙ或Ｖａｌ，而Ｃ３植物中则为Ａｓｐ，所有植物都不含有Ａｓｘ（Ｂ）、Ｇｌｘ（Ｚ）、Ｘａａ（Ｘ）。Ｃ４植物酸碱性氨基酸的比例略小于Ｃ３植物。Ｃ４植物中非极性氨基酸、极性氨基酸含量略高于Ｃ３植物（表１）。
２．１．２ＰＥＰＣ氨基酸序列分析利用ＤＮＡＭＡＮ［２２］进行多序列比对，比较８种植物的氨基酸序列。参数选择：完全比对；多重比对；空位开放罚分：１０；空位延伸罚分：１；延迟趋异序列：３０％；蛋白质加权ＧＯＮＮＥＴ。蛋白质空位参数试用亲水罚分和残基特异罚分。在Ｃ３和Ｃ４植物中不同的氨基酸位点共有２２处，见图１中用浅色或深色为背景的位点，其中“…”表示省略的氨基酸。据此将进一步研究这些氨基酸位点，观察造成的空间结构活性区域有无变化。
２．２ＰＥＰＣ二级结构分析
用ＳＯＰＭＡ对ＰＥＰＣ二级结构进行预测，ＰＥＰＣ结构元件以α-螺旋、无规则卷曲为主，延伸链和β-折叠散布于整个蛋白质中。没有发现如３１０ ｈｅｌｉｘ、Ｐｉ ｈｅｌｉｘ、Ｂｅｔａ ｂｒｉｄｇｅ、Ｂｅｎｄ ｒｅｇｉｏｎ等其他结构（表２）。对于一级结构中Ｃ３、Ｃ４植物不同处，在进行二级结构预测后，也发现有３处不同（图１）。在图１的阴影中，Ｃ４植物在Ｅ（谷氨酸）与Ｓ（丝氨酸）处表现为ｃ（无规则卷曲）与ｈ（α-螺旋）的链接、Ｃ３植物表现为Ｅ与Ｓ均为ｃ，而之后的Ｓ与Ｄ（天冬氨酸）处为ｃ与ｈ的链接。Ｃ４植物在Ｐ（脯氨酸）到Ｖ（缬氨酸）之间均为ｃ的链接，Ｃ３植物Ｒ（精氨酸）到Ｖ之间有两个ｃ变成了ｅ（延伸链），Ｃ４植物在Ｋ（赖氨酸）和两个Ｑ（谷氨酰胺）之间是表现为两个ｔ（β-折叠）与ｅ的链接，而Ｃ３植物ＫＱＥ之间为两个ｃ和ｅ的链接。分析这些二级结构的不同，为以后的三级结构的比对提供了基础，还有利于进一步去研究是否由于这些位点的不同而造成了ＰＥＰＣ在Ｃ３和Ｃ４植物中的差异。
２．３ＰＥＰＣ氨基酸序列结构域功能的分析
通过ＰＲＯＳＩＴＥ分析，８种植物都具有两个符合ＰＥＰＣ活性的位点［ＶＴＩ］－ｘ－Ｔ－Ａ－Ｈ－Ｐ－Ｔ－［ＥＱ］－
ｘ（２）－Ｒ－［ＫＲＨＡＱ］（Ｈ是活性残基位点）；［ＩＶＬＣ］－Ｍ－［ＬＩＶＭ］－Ｇ－Ｙ－Ｓ－Ｄ－Ｓ－ｘ－Ｋ－［ＤＦ］－［ＳＴＡＧ］－Ｇ（Ｋ是活性残基位点）和一个保守序列Ｍ－Ｆ－Ｈ－Ｇ－Ｒ－Ｇ－Ｇ－Ｔ－Ｖ－Ｇ－Ｒ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｐ－Ｔ－Ｈ－Ｌ－Ａ－Ｉ－Ｌ－Ｓ－Ｑ－Ｐ－Ｐ－［ＤＥ］－Ｔ－Ｉ－Ｈ－Ｇ－Ｓ－［ＬＰ］－Ｒ－Ｖ－Ｔ－Ｖ－Ｑ－Ｇ－Ｅ－Ｖ－Ｉ－Ｅ－Ｑ－Ｓ－Ｆ－Ｇ－Ｅ－Ｅ－Ｈ－Ｌ。说明这几种植物中都具有ＰＥＰＣ活性，只是活性位点和保守序列的起始位点有所区别（表３），这应该是和它们的氨基酸序列起始位置有关。
２．４ＰＥＰＣ的三级结构预测
将玉米ＰＥＰＣ氨基酸序列上传到ＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ的建模服务器中进行ＰＥＰＣ结构的三维建模，预测得到一个同源性较高的蛋白质结构数据１ＪＱＯ ｃｈａｉｎ Ａ，同源性为９９．７％，符合同源建模条件，从而构建目标序列的三级结构（图２）。
利用ＰＲＯＣＨＥＣＫ对模建结果进行检测，作Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ点图，统计位于最适合区、附加允许区、一般允许区和不允许区残基的比率。Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ点图能够将蛋白质的主链中的ｐｈｉ和ｐｓｉ的二面角角度以图示的方式显示。最深色区域是最理想的phi角和psi角分布区域，而白色区域则为不合理区域。因而如果预测的蛋白质残基的二面角有９０％以上位于最深色区域，则表明其有稳定的空间结构。图３是玉米ＰＥＰＣ蛋白质的Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ点图，其中９４．２％位于最适合区，５．７％位于附加允许区，０．１％位于一般允许区，没有氨基酸位于不允许区域。从图中可以看出，模拟得到的玉米ＰＥＰＣ蛋白质的三维结构的氨基酸残基有９４．２％位于Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ点图中合理区域，从理论上表明模拟得到的玉米ＰＥＰＣ的三维结构是可靠的。
３讨论
根据经典的Ｃ４光合知识，Ｃ４植物有叶肉细胞和维管束鞘细胞的分化，进行Ｃ４光合途径所必需的多酶系统分别定位于此两类具有叶绿体的细胞中，而且Ｃ４光合途径是受多基因控制且各基因独立遗传，Ｃ３植物存在的内源的Ｃ４循环酶及转运蛋白质，都具有明确的生理功能，因而通过个别基因的过量表达增加其产物的活性，不能在Ｃ３植物中建立起完整的Ｃ４循环，还可能干扰Ｃ３植物的正常代谢，因此，把Ｃ３植物转化为Ｃ４植物是不可能的，但是Jiao等［２３］通过转ＰＥＰＣ基因，水稻具有了类似初级的Ｃ３－Ｃ４中间型的特征。用生物信息学方法对已知ＰＥＰＣ序列进行比对分析，从而对其结构和功能进行推断和预测，为我们将ＰＥＰＣ基因转入Ｃ３作物以有效提高作物的光合生产力提供了尽可能多的信息，能为选择合适的试验方法提供理论参考，为进一步对该基因的功能研究提供线索。此外要培育类Ｃ４作物，进一步提高光合效率，可能需要Ｋｒａｎｚ结构，以免光呼吸ＣＯ２的外溢，这些都有待进一步研究。
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