【JC-1单标法和JC-1/PI双标法荧光探针检测山羊附睾精子线粒体膜功能的研究】champion单标双标区别

　　摘要：为准确、全面研究超低温冷冻技术对山羊附睾精子线粒体膜电位的影响效果，本试验采用荧光探针ＪＣ－１单标和ＪＣ－１／ＰＩ双标２种荧光染色方法，通过流式细胞仪和荧光显微镜两种检测手段对精子线粒体膜电位（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，MMP）变化进行检测分析，用ＪＣ－１单独染色，能准确、快速地区分高、低ＭＭＰ精子，但不能明确区分精子的存活状态，采用ＪＣ－１与碘化丙啶（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）双标法，则能明显判定精子的存活状态。通过对绒山羊附睾精子在冷冻前和解冻后线粒体膜电位检测，结果表明，单标记后高ＭＭＰ精子尾部呈橙红色，低ＭＭＰ 精子尾部为绿色；双标后死亡精子头部呈红色（ＰＩ＋）。对两种检测手段的比较研究，结果显示，荧光显微镜能够有效地区分出高、低ＭＭＰ 及死精子，但对于活精子中ＭＭＰ的高低检测效果不理想；流式细胞仪则能够有效地区分活精子ＭＭＰ 的高低，而且结果准确，速度快，敏感性高。试验表明，两种检测方法相关性很高，分析同一处理样品时用ＪＣ＋％和ＪＣ＋／ＰＩ－％检测结果呈显著正相关（ｒ＝０．８１５，ｒ＝０．９８２，Ｐ＜０．０１）。因此，对于精子线粒体ＭＭＰ 的分析，采用ＪＣ－１单染与ＪＣ－１／ＰＩ双染的方法，利用流式细胞仪与荧光显微镜进行联合检测，能比较全面、准确的反映出精子线粒体的功能状态。
　　关键词：山羊；精子；线粒体膜电位；ＪＣ－１
　　中图分类号：Ｓ８２７文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）12－2503-03
　　
　　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｏａｔ Ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ Ｓｐｅｒｍ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｙ ＪＣ－１ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ＪＣ－１／ＰＩ Ｃｏ－ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅ
　　
　　ＣＨＡＩ Ｊｕ１，ＧＡＯ Ｒｉ－ｍｉｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｊｉａ－ｘｉｎ１，ＭＥＮＧ Ｋｅ－ｇｅ－ｒｉ－ｌｅ１，ＷＡＮＧ Ｈｕｉ－ｍｅｉ３，ＺＨＡＯ Ｙａｎ－ｈｏｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｚｈｉ－ｘｉｎ１，ＺＨＡＮＧ Ｗｅｎ－ｇｕａｎｇ１，ＬＩ Ｊｉｎ－ｑｕａｎ１
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　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＪＣ－１ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｕａｌｌｙ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ （ＭＭＰ） ａｎｄ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－MMP ａｎｄ ｌｏｗ－ＭＭＰ ｓｐｅｒｍ ａｃｃｕｒａｔｌｙ ａｎｄ ｒａｐｉｄｌｙ， ｂｕｔ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｉｎｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｗａｓ ａｌｉｖｅ ｏｒ ｎｏｔ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｃｏ－ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｓ ｏｆ ＪＣ－１ ａｎｄ ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ （ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ， ＰＩ） ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｇｏａｔ ｆｒｅｓｈ ａｎｄ ｐｏｓｔ－ｔｈａｗ ｓｅｍｅｎ． Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗｅｒｅ ｕｔｉｌｉｚｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｓｐｅｒｍｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｄｅａｄ ｓｐｅｒｍ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｗａｓ ｒｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｈｉｇｈ－ＭＭＰ ｓｐｅｒｍ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｗａｓ ｏｒａｎｇｅ， ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｏｆ ｌｏｗ ＭＭＰ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｓ ｗａｓ ｇｒｅｅｎ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｗｏ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅａｎｓ were ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｃｏｕｌｄ ｓｅｐａｒａｔｅ ｈｉｇｈ－MMP ａｎｄ ｌｏｗ－ＭＭＰ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｂｕｔ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＭＭＰ ｏｆ ｌｉｖｅ ｓｐｅｒｍ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｉｄｅａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ． Ｉｎ ｃｏｎｔｒａｓｔ， ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＭＭＰ ｏｆ ｌｉｖｅ ｓｐｅｒｍ ａｃｃｕｒａｔｌｙ ａｎｄ ｒａｐｉｄｌｙ ａｎｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈ ｃｏｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ（ｒ＝０．８１５，ｒ＝０．９８２，P＜0.01）． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｕｓｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｉｇｈｔ ｒｅｆｌｅｃｔ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｓｐｅｒｍ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｏａｔ； ｓｐｅｒｍ； MMP； ＪＣ－１
　　
　　线粒体是活性氧形成的主要场所，活性氧的生成是导致电子传递过程的中断，氧化磷酸化与电子传递的耦合是维持高的线粒体膜电位（△ψｍ）的重要环节，而这种高的线粒体膜电位状态是细胞和精子维持活性在线粒体中产生ＡＴＰ能量所必需的保障，因此，在精子整个代谢过程所需的能量主要由线粒体提供［１，２］。线粒体活性的改变会影响精子的能量供应［３］，且线粒体还是细胞凋亡的调控中枢［４］。因此，线粒体的功能状态是精子功能质量的一个关键性指标。精子的线粒体上存在着跨膜电位，因此对线粒体活性的评价主要通过检测线粒体的跨膜电位变化来分析。目前，检测精子线粒体活性的荧光探针主要有罗丹明１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３，Ｒ１２３）、花青苷（Ｃｙａｎｉｎｅ）和５，５′，６，６′－四氯－１，１′，３，３′－四乙基苯并咪唑基-羰化青碘（５，５′，６，６′－ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ－１，１′，３，３′-ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ－ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｉｏｄｉｄｅ，ＪＣ－１）等。ＪＣ－１是一种亲脂性阳离子荧光染料，是检测精子线粒体膜电位△ψｍ最理想的荧光探针，ＪＣ－１在检测精子线粒体功能过程中，当线粒体膜电位△ψｍ高时，能承受逆转运自由地穿过细胞膜，从单体形成聚合体，特异性地与线粒体内膜结合，当精子ＭＭＰ低时，以单体形式存在，发绿色荧光（５１０～５２０ ｎｍ）；当ＭＭＰ高时，形成二聚体，发橙色荧光［５］。而且ＪＣ－１染色的特异性好，仅在线粒体部位发橙色或绿色荧光。虽然单独使用ＪＣ－１染色能判断精子ＭＭＰ的高低，但不能准确地判断精子的存活状态。而碘化丙啶（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）是一种死精子特异性荧光染料，能特异性地区分精子的状态。当精子的质膜受损时，ＰＩ能进入精子内部与ＤＮＡ结合发出红色荧光；而当精子质膜具有完整的功能时，ＰＩ不能进入精子内部，精子则不发荧光。目前检测精子线粒体膜电位变化主要是使用荧光显微镜，这种方法可明确区分精子线粒体的高ＭＭＰ、低ＭＭＰ和死精子［６］，与流式细胞仪检测效果相比，后者更准确、快速。报道在牛和人的精子检测中曾用过这种方法，其他动物很少报道［７］。使用流式细胞仪可快速判定精子的状态，在评价低温精液冷冻保存以及冻精的受胎率等繁殖力指标效果是非常重要的，为此，本试验采用ＪＣ－１单染与ＪＣ－１／ＰＩ双染色法，分别使用流式细胞仪与荧光显微镜分析绒山羊精子的线粒体膜电位△ψｍ的变化，研究冷冻过程对山羊精子线粒体功能的影响效果。
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　　１．１主要试剂与仪器
　　Ｔｒｉｓ（三羟甲基氨基甲烷，Ｔ１５０３），Ｄ－（－）－果糖（Ｆ０１２７），柠檬酸（Ｃ２４０４），Ｄ－（＋）－葡萄糖，蔗糖（Ｓ０３３５，ＡＭＲＥＳＣＯ），柠檬酸钠，青霉素，链霉素，ＪＣ－１（Ｃ２００６），ＰＩ（Ｐ４１７０），甘油（Ｇ６２７９）。以上试剂均购自Ｓｉｇｍａ公司。
　　冷冻细管（法国），流式细胞仪（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ型，美国Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｎｓｏｎ公司），荧光显微镜（ＢＸ４１，ＯＬＹＰＵＳ），漩涡混合器（ＸＷ２８０Ａ型，上海医科大学仪器厂），低速离心机（８００Ｂ型，上海安亭科学仪器厂），恒温磁力搅拌器（７８ＨＷ－１型，杭州仪表电机厂），数显电热培养箱（ＨＰＸ－９０８２ＭＢＥ，上海博迅实业有限公司医疗设备厂），电热恒温水浴锅（ＤＧＳＹ，北京市医疗设备厂），液氮容器（ＤＯＮＧＹＡ ＹＤＳ－３０，四川乐山市东亚机电工贸有限公司）。
　　１．２冷冻稀释液配制
　　基础稀释液的配制：三羟甲基氨基甲烷３．０７ ｇ，果糖０．６３ ｇ，葡萄糖０．５ ｇ，蔗糖０．１３ ｇ，柠檬酸１．６４ ｇ， 卵黄１５ ｍＬ（新鲜的小鸡蛋），甘油６ ｍＬ（Ｓｉｇｍａ），分别加入青霉素、链霉素各１０万ＩＵ，用７９ ｍＬ去离子水溶解。溶解后，用０．４５ μｍ滤器过滤。
　　ＪＣ－１染色液配制：将ＪＣ－１用二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），配制成０．５ ｍｇ／ｍＬ溶液，低温储存备用，将ＰＩ用ＰＢＳ配成２０ ｍｇ／Ｌ的溶液。
　　１．３附睾精子样品
　　绒山羊附睾精子来自当地的屠宰场（内蒙古呼和浩特市玉泉区），从屠宰后的成年公白绒山羊收集带有阴囊的睾丸，用水盒保存（注意样品不能与冰袋直接接触），尽快运到内蒙古自治区动物遗传与繁殖重点实验室，４℃保存，备用。
　　１．４精子收集、冷冻及精子常规检查
　　睾丸在４ ℃放置２２ ｈ后 （死后２４ ｈ内）从阴囊里分离出来，把附睾尾用手术刀在表面处含有附睾小管的地方对切开，放在培养皿中，用不含卵黄的基础液在３７℃下进行孵育３０ ｍｉｎ，并用ＰＢＳ洗涤。完成后，将符合要求的新鲜精液分为Ａ、Ｂ两组，按１∶４的比例用稀释液（都含卵黄便于对比）进行稀释，Ａ组样品在室温（２３±１）℃下静置１０ ｍｉｎ 后进行平衡，Ｂ组直接平衡。平衡时放在一个装有５０ ｍＬ室温水的１００ ｍＬ的烧杯中，在４℃冰箱使其缓慢降温平衡３ ｈ，然后进行薰蒸，薰蒸时距液氮４ ｃｍ处，薰蒸时间９ ｍｉｎ，完后直接投入液氮，３０ ｍｉｎ后在３７ ℃水浴锅中解冻，解冻时间２０ ｓ。
　　１．５线粒体膜电位的检测
　　每一组进行２个试验处理，分别进行ＪＣ－１单染和ＪＣ－１／ＰＩ双染，取１０ μＬ精子悬液，加入６．８ μＬ ＪＣ－１染色液，置于３７℃恒温湿盒中，避光染色３０ ｍｉｎ，在双染中再加入１０ μＬ ＰＩ溶液，避光染色５ ｍｉｎ，离心弃上清，ＰＢＳ 重悬，调精子密度为５×１０６个／ｍＬ，进行检测。荧光显微镜检测：将染色后的精液，涂片后于荧光显微镜（１０×４０）下观察不同颜色状态的精子，每个涂片至少统计精子数为２００个。流式细胞仪检测：采用美国ＢＤ公司ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ型流式细胞仪进行检测，用４８８ ｎｍ波长激发，应用前向散射光（ＦＳＣ）和侧向散射光（ＳＳＣ）射门后，通过荧光通道ＦＬ１－Ｈ和ＦＬ２-Ｈ收集荧光信号，并使用电子补偿以纠正绿色荧光（单体）和红色荧光（聚合物）重叠部分。每份精子悬液样本获取１０ ０００个细胞，应用ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ 软件获取数据。
　　１．６统计分析
　　分析的数据均采用ＳＡＳ ９．０数据统计方法，采用配对ｔ 检验，统计各组之间的差异和相关性。
　　２结果
　　２．１荧光显微镜检测不同ＭＭＰ精子
　　两个处理组中，采用ＪＣ－１单标法可以清楚的看到高ＭＭＰ和低ＭＭＰ精子，采用ＪＣ－１／ＰＩ双染色法，可以清晰的区分精子的高、低ＭＭＰ精子及精子存活状态。结果见表１，其中在ＪＣ－１单标法中，样品尾部线粒体呈桔红色荧光的精子为高ＭＭＰ精子，样品尾部线粒体呈绿色荧光的精子为低ＭＭＰ精子，样品尾部与头部都呈绿色的精子是线粒体无活性的精子，样品头部呈绿色尾部也呈较亮的绿色精子是有活性的低ＭＭＰ的精子（见图１－Ａ、图１－Ｂ和图１－Ｃ）；在ＪＣ－１／ＰＩ双染中，样品头部呈绿色尾部呈橙红色荧光（ＪＣ－１＋／ＰＩ－）的精子为高ＭＭＰ精子，且是有活性的精子（见图２－Ａ），样品头部呈红色尾部呈绿色荧光（ＪＣ－１－／ＰＩ＋）的为低ＭＭＰ死精子（见图２－Ｂ），样品头部与尾部都呈绿色荧光的（ＪＣ－１－／ＰＩ－）精子为低ＭＭＰ的活精子（见图２－Ｃ）。样品头部发荧光的精子用红色箭头标记，尾部发荧光的用白色箭头标记（见图１、图２）。
　　２．２ＦＣＭ分析结果
　　采用ＪＣ－１单标法和ＪＣ－１／ＰＩ双标法分析精子细胞的线粒体膜电位时，单标法能将高、低ＭＭＰ明显的区分开来（见图３），精子采用ＪＣ－１／ＰＩ双标时法能将精子线粒体的ＭＭＰ高、低及精子的死、活区分开（图４）。采用ＪＣ－１染色时，确定了高的ＭＭＰ和低的ＭＭＰ精子的比例，采用ＪＣ－１／ＰＩ染色时，确定了ＪＣ－１＋／ＰＩ＋、ＪＣ－１＋／ＰＩ－、ＪＣ－１－／ＰＩ＋和ＪＣ－１－／ＰＩ－的关系（见表１），ＪＣ－１＋／ＰＩ＋为高的ＭＭＰ死精子，ＪＣ－１＋／ＰＩ－为高ＭＭＰ的活精子，ＪＣ－１－／ＰＩ＋是低ＭＭＰ的死精子，ＪＣ－１－／ＰＩ－是线粒体功能丧失的活精子。
　　２．３荧光显微镜与ＦＣＭ检测分析中单标法和双染法在不同处理组中相关性分析
　　见表２，在不同处理组中高ＭＭＰ精子检测中，在精子线粒体ＭＭＰ和活的与死的精子检测中，ＦＣＭ检测与荧光显微镜检测不存在统计学差异，二者相关性显著。ＪＣ－１染色法与ＪＣ－１／ＰＩ染色法的高ＭＭＰ精子百分率，在流式细胞仪上检测结果差异不显著（Ｐ＞０．０５）；采用ＪＣ－１／ＰＩ染色分析显示，荧光显微镜与流式细胞仪检测的高ＭＭＰ精子结果差异也不显著（Ｐ＞０．０５）。
　　３讨论
　　线粒体的主要功能是产生能量，可为精子运动提供ＡＴＰ。用于检测线粒体膜电位（ＭＭＰ）比较常用的阳离子荧光染料为花青苷（Ｃｙａｎｉｎｅ）、Ｒ１２３、亲脂性阴离子为Ｏｘｏｎｏｌ以及本研究用的ＪＣ－１等［８］，Ｃｙａｎｉｎｅ染料中以ＤｉＯＣ５（３）和ＤｉＳＣ３（５）反映膜电位的灵敏度较高，使用较多，但ＤｉＯＣ５（３）容易被细胞中的过氧化酶氧化。目前最新的检测手段为利用流式细胞术检测线粒体膜电位的变化，其机制为线粒体存在内负外正膜电位，Ｒ１２３也是一种亲脂性阳离子荧光染料，在正常生理条件下带有１个正电荷，能顺利通过活细胞的细胞膜和线粒体膜，进入细胞后可以选择性地富集在线粒体上，线粒体富集Ｒ１２３的量随线粒体膜电位的变化而变化，因此测定线粒体罗丹明１２３荧光强度可以反映线粒体膜电位及变化情况，ＪＣ－１是一种亲脂性阴离子荧光染料，是检测线粒体膜电位△ψｍ的理想荧光探针，ＪＣ－１是一种碳氰化合物类荧光染料，在浓度或线粒体膜电位低时以单体存在，激发波长为４８８ ｎｍ，发射波长为５２９ ｎｍ，当浓度升高时形成聚合体，此时激发波长为４９０ ｎｍ，发射波长为５９０ ｎｍ，呈红橙色荧光。线粒体膜电位分析采用比例法，由于ＪＣ－１能特异地与线粒体内膜结合，只在线粒体内膜崩解时才释放出来，因此，其检测结果可靠，敏感性高，在细胞内以聚合物（Ｊ－ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）和单体（ｍｏｎｏｍｅｒ）两种不同形式存在。在ＭＭＰ较高时，ＪＣ－１聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生橙红色荧光；在ＭＭＰ较低时，ＪＣ－１不能聚集在线粒体的基质中，此时ＪＣ－１为单体，可以产生绿色荧光。以往对精子ＭＭＰ的检测多数通过在荧光显微镜下镜检，现在可以进行流式细胞仪与荧光显微镜联合对精子线粒体膜电位进行检测，流式细胞术可以快速、高通量、多参数的定量分析，更有利于精子ＭＭＰ的检测［９］。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　由于使用ＪＣ－１单标法在确认精子的死活时流式细胞不能十分准确，本试验同时采用双标法（ＪＣ－１／ＰＩ）弥补单标的不足，检测山羊精子的线粒体时，用ＪＣ－１／ＰＩ染色分析了精子活力，由于ＰＩ能够渗透进质膜不完整的精子，并能够激发出强的红色荧光特征，利用流式细胞仪与荧光显微镜检测样本时，均取得了较好的结果，这也与Ｇａｒｎｅｒ等［１０］在牛精子上的检测结果类似。因此，在使用ＪＣ－１／ＰＩ染色时流式细胞仪能够快速地分析死精子与活精子。在使用ＪＣ－１染色时，荧光显微镜与流式细胞仪在区分高、低ＭＭＰ精子方面取得较一致结果，差异不显著，存在好的线性相关性（ｒ＝０．８１５，ｒ＝０．９２２）。本试验在荧光显微镜和流式细胞仪检测精子线粒体功能上，用ＪＣ－１和ＰＩ联合染色后，准确、快速地分析了绒山羊附睾精子的线粒体ＭＭＰ的高低，这与Ｇａｒｎｅｒ等［１０］用此方法在流式细胞仪检测牛精子线粒体功能上的结果一致。本研究发现，在高ＭＭＰ精子检测中，ＪＣ－１染色法与ＪＣ－１／ＰＩ染色法的检测结果差异不显著（Ｐ＞０．０５），具有很强的相关性；同时采用ＪＣ－１／ＰＩ染色时，荧光显微镜与流式细胞仪在检测高ＭＭＰ精子方面具有强的线性相关性（ｒ＝０．９８２）。同时荧光显微镜和流式细胞仪两种检测方法各有其优势，由于ＪＣ－１在精子线粒体内会随ＭＭＰ的变化激发２种荧光，绿色荧光（５１０～５２０ ｎｍ）和橙色荧光（５９０ ｎｍ），因此在与ＰＩ染料联合应用时，会出现荧光重叠现象［１０］，ＪＣ－１的多聚体发出的橙色荧光会与ＰＩ的红色荧光部分重叠［１１］。尤其在检测高ＭＭＰ死精子和低ＭＭＰ的死精子时，会出现红色荧光与橙色荧光部分重叠，这样在流式细胞仪检测中不利于区分，但用荧光显微镜则可很准确地区分开来，因为红色荧光的ＰＩ着色于精子头部，而ＪＣ－１着色于精子尾部，所以荧光显微镜可以有效地区分高、低ＭＭＰ死精子。这也是本研究同时用荧光显微镜和流式细胞仪分析山羊附睾精子线粒体膜电位的原因之一，这与Ｇａｒｎｅｒ等［１0］在使用ＪＣ－１／ＰＩ染色检测牛精子的线粒体功能时，流式细胞仪检测高、低ＭＭＰ死精子存在困难是相一致的。而且通过荧光显微镜观察也发现，虽然死精子中仍有部分精子存在高能线粒体，但其荧光强度，与活精子相比要弱一些［１２］。同时在利用显微镜下检测时，不能很好的观测低ＭＭＰ的活精子，而流式细胞仪的检测是以单个细胞通过的方式进行，所以可以避开细胞间的干扰，可将高ＭＭＰ活精子与低ＭＭＰ活精子有效地分开。所以在采用ＪＣ－１／ＰＩ染色对山羊精子的死活以及死活精子ＭＭＰ的检测时，流式细胞仪能够有效地区分精子的死活及活精子ＭＭＰ的高低，但不能准确检测死精子ＭＭＰ；而荧光显微镜能够有效地检测死精子ＭＭＰ的高低，但对于活精子ＭＭＰ的检测，效果不理想。采用ＪＣ－１／ＰＩ染色检测山羊精子的线粒体功能，将流式细胞仪与荧光显微镜联合使用，能比较全面地反映出精子线粒体的功能状态。
　　总之，应用流式细胞术ＪＣ－１单标法检测精子ＭＭＰ是可行的，精子ＪＣ－１＋％可作为分析冷冻过程中精子活力受损的一个关键指标，检测精子ＪＣ－１＋％亦为进一步研究冷冻稀释液中添加物对精子冷冻前后的影响效果，分析活力下降机理，精子ＭＭＰ变化与冷冻技术的相关性，提供重要的参考。本研究用两种染色方法和两种检测手段确定了绒山羊附睾精子的线粒体活性和精子的死活，用发橙红色荧光精子百分率，即ＪＣ－１＋％，表示高ＭＭＰ精子的比例，用发红色的荧光和绿色的荧光来检测精子的存活（ＰＩ＋／ＰＩ－），实现了对精液样本ＭＭＰ和活率的快速、可靠检测，在研究冷冻精液稀释液配方及提高冷冻精液活力和受胎率方面提供重要的分析研究方法。
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　　［６］ ＨＯＯＲＮＳＴＲＡ Ｄ，ＡＮＤＥＲＳＳＯＮ Ｍ Ａ， ＭＩＫＫＯＬＡ Ｒ， ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｏｘｉｎｓ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，２００３，１７：７４５－７５１．
　　［７］ ＧＡＲＮＥＲ Ｄ Ｌ，ＴＨＯＭＡＳ Ｃ Ａ．Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅ ＪＣ－１ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｅｒｍ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，１９９９，５３：２２２－２２９．
　　［８］ ＭＡＲＣＨＥＴＴＩ Ｃ，ＪＯＵＹ Ｎ，ＬＥＲＯＹ－ＭＡＲＴＩＮ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｎｅｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ［Ｊ］．Ｈｕｍ Ｒｅｐ ｒｏｄ， ２００４， １９ （１０）：２２６７－２２７６．
　　［９］ ＧＡＲＮＥＲ Ｄ Ｌ，ＴＨＯＭＡＳ Ｃ Ａ． ＪＯＥＲＧ Ｈ Ｗ，ｅｔ ａｌ． Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｅｒｍａｏｔｏｚｏａ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，１９９７，５７，１４０１－１４０６．
　　［１０］ ＧＡＲＮＥＲ Ｄ Ｌ，ＴＨＯＭＡＳ Ｃ Ａ．Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅ ＪＣ－１ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｅｒｍ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，１９９９，５３：２２２－２２９．
　　［１１］ ＣＯＳＳＡＲＩＺＺＡ Ａ，ＢＡＣＣＡＲＡＮＩ－ＣＯＮＴＲＩ Ｍ，ＫＡＬＡＳＨＮＩＫＯＶＡ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｅｗｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｓｉｎｇｔｈｅ Ｊ－ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｃａｔｉｏｎ５，５′，６，６′－ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ－１，１′，３，３′－ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ－ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｉｏｄｉｄｅ（ＪＣ－１）［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１９９３，１９７：４０-４５．
　　［１２］ ＧＵＴＨＲＩＥ ＨＤ，ＷＥＬＣＨ ＧＲ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ Ｐｅｒｃｏｌｌ－ｔｒｅａｔｅｄ ｖｉａｂｌｅ ｂｏａｒ ｓｐｅｒｍ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］． Ｊ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ，２００６，８４：２０８９－２１００．
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
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