标准蛋白曲线制作 标准蛋白曲线
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量
一、 标准曲线
一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、 蛋白质含量测定方法
1、 凯氏定氮法
2、 双缩脲法
3、 Folin-酚试剂法
4、 紫外吸收法
5、 考马斯亮蓝法
三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
（一）、试剂：
1、 考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、 标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：
1、722S型分光光度计。
2、移液管。
（三）、标准曲线制作：
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
1、A595nm
2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图 ，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：
1、 玻璃仪器要洗涤干净。
2、 取量要准确。
3、 玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
4、 对照：用被测物质以外的物质作空白对照。
药品的配制（磷酸缓冲液的配制）
一、药品的配制步骤
（一）、实验准备：
1、 准备所需的药品和玻璃仪器。
2、 洗涤。（怎样洗涤算干净？）
（二）、计算：
1、百分比浓度计算：
1)、G/V比
例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。
2）、V/V比：
例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X, X=75ml。取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。
乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。
3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素
如Fe的含量。
2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。
1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。
M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G（g）/摩尔质量
2）、0.1mMNaCl配100ml
mM=毫摩尔数/体积（L） 称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g
毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量
3）、0.1uNaCl配100ml
mM=微摩尔数/体积（L） 称取NaCl0.1×0.1×40=0.4mg
微摩尔数=G（ug）/摩尔质量 称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug
3、 混合溶液配制的计算：
如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。
注意：1、分别标定体积计算
2、分别配制再混合，但总体积不能 为100ml
（三）、标量：
1、 根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器，如量筒或移液管。
2、 电子分析天平。
（四）、溶解：
1、 根据药品配置要求选择溶剂。蒸馏水，双蒸水，无离子水等。
2、 只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤烧杯三次左右，直到洗涤干净。
小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）。
如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解，但pH应在被要求的范围内。
3、 加热促进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好。如:配0.1%的淀粉，水裕加热（温度在80-90。C），过量会糊化。
（五）、定容：
1、 用容量瓶定容；
2、 用玻璃棒引流或用小漏斗；
3、 用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。要求刻度与液体凹面相切为止（眼睛可视）；
4、 上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可。(注意不再定容了，防止溶液漏掉。)
（六）、装入试剂瓶，贴上标签。
标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等。
（七）、清理实验场所。