裂褶多糖_高相对分子质量裂褶多糖的制备与结构鉴定出境

　　叶　诚　周蓬蓬　余龙江　何　峰　鲁明波 　　摘 要：以裂褶茵(Schizophyllum commune)发酵生产的培养物为研究对象，经过活性炭脱色、Sevag法脱杂蛋白、乙醇沉淀得粗多糖，再经Sephadex G-200柱层析分离纯化得裂褶多糖纯品，通过Sephadex G-200凝胶层析法测得其平均分子质量为436kDa；由气相色谱、红外光谱、高碘酸氧化、Smith降解、13C核磁共振等方法表征其化学结构，推测其结构为具有(1→6)分支的β-(1-3)-D-葡聚糖：其组成重复单元应该合有3个主链糖基和一个单糖分支，主链的取代发生在C-1和C-3之间，即为1→3糖苷键；分支发生在C-1和C-6之间，即为1→6糖苷键，其中分支点在主链糖基的C-6上。
　　关键词：裂褶菌；胞外多糖；分离化；结构鉴定
　　中图分类号：Q93
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2007)02-0100-05
　　
　　多糖是一类大分子化合物，一般由一百个以上甚至几千个单糖通过糖苷键连接而成，近年来，随着分子生物学和细胞生物学的发展，人们得到了有关糖的结构和功能越来越多的信息，逐步认识到糖是除核酸和蛋白质之外另一重要的生命物质，具有多种生物学功能，多糖尤其是相对分子质量大于50kDa的高相对分子质量多糖，在增强免疫、抗肿瘤等方面具有显著的生物活性，本文以裂褶菌(Schizophyllum commune)发酵培养物为研究对象，从中提取粗裂褶多糖，并由该胞外多糖(Schizophyllan，简称SPG)进一步分离纯化得到一种高相对分子质量裂褶多糖SPG13，分析了纯多糖的理化性质，为进一步开发应用奠定了重要基础。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1材料
　　1.1.1 菌种
　　本研究菌种购于中科院微生物研究所菌种保藏中心，经鉴定，确定其为裂褶菌(Schizophylluncommune)。
　　1.1.2主要试剂与仪器
　　Sephadex G-200，蓝色葡聚糖和标准相对分子质量多糖(Dextram T-10，Dextram T-40，DextramT-70，Dextram T-500)(Pharmacia公司)，其他试剂均为进口或国产分析纯，UV-2100型可见紫外光分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；GC一9790气相色谱仪；VERTEX-70傅立叶变换显微红外／拉曼光谱仪，德国Bruker公司；AV400双通道全数字化傅立叶超导核磁共振谱仪，瑞士Bruker公司。
　　1.1.3样品制备
　　以裂褶菌发酵培养物为材料，收集发酵液，8000r/min，离心20min，弃沉淀，上清液中加入粉末状活性炭，水浴，加热搅拌15min，抽滤，滤液置于旋转蒸发仪中，浓缩体积后得粘稠、透明状液体，脱色后的发酵液用Sevag法除蛋白，重复3次后，向已脱蛋白的发酵液中加入2.5倍体积的95％乙醇，出现大量白色絮状沉淀；摇匀，4℃静置过夜，6000r/min离心20min，收集沉淀，冷冻干燥，得粗多糖。
　　
　　1.2方法
　　1.2.1 SPG多糖的理化性质的测定方法
　　观察SPG粗多糖的颜色、状态和溶解情况，并进行化学性质实验：苯酚―硫酸反应、蒽酮，硫酸反应，
　　1.2.2柱层析纯化
　　脱色，脱杂蛋白后的SPG粗多糖进行柱层析分离、纯化，分别选取Sephadex G-100、SephadexG-150、Sephadex G-200为填料装填于1.6cm×100cm层析柱中，比较其以0.5％和0.9％氯化钠溶液洗脱时的分离效果，流速控制在大约0.3mL/min，每管收集3mL，分部收集，每管取少量收集液，苯酚一硫酸法检测，490nm测其OD值，按照管号对光密度绘制洗脱曲线，对比洗脱效果，选取最适洗脱条件；选取最佳填料与条件进行多糖的纯化，将最大峰处的洗脱液合并，减压浓缩，冷冻干燥，得到多糖纯品。
　　
　　1.2.3 紫外及红外光谱分析
　　试样配成0.1％水溶液，对190～400nm区间进行紫外扫描，SPG1粉末经KBr压片，在4000am-113～500CB-1区间进行红外扫描。
　　1.2.4 Sephadex G-200凝胶过滤测定相对分子质量
　　称取SephadexG-2008.5g，加双蒸水溶涨72h，装填于层析柱中(1.6 cm×100cm)，用0.9％氯化钠水溶液平衡3d，分别称取已知分子质量的葡聚糖T500、T70、T40、T10和蓝色葡聚糖各3mg，用少量蒸馏水溶解后依次上柱，用0.9％氯化钠水溶液洗脱，每3mL收集一管，苯酚一硫酸法显色，490nm测其OD值检测各糖的洗脱体积Ve，用蓝色葡聚糖测出外水体积Vo，依Ve/Vo与相对分子质量的对数关系得标准曲线，称取SPG13mg，用少量水溶解，以同样条件上柱洗脱。
　　1.2.5 GC检测单糖组成分析
　　准确称取SPG120.0 mg于安瓿瓶中，加入1tool/L硫酸3.0 mL，封口，置90℃烘箱水解6～12h，用碳酸钡缓慢中和至pH=7.0，离心(4000r/min，10min)，上清液浓缩至干；加入盐酸羟胺90mg，吡啶4mL，在90℃的水浴中加热反应10min后取出，放至室温；加4mL乙酸酐再置于90℃水浴中反应20min，得糖腈乙酰酯衍生物，再准确称取各标准单糖10mg，以同样的方法制成标准品的糖腈乙酰酯衍生物，进行气相色谱分析，色谱条件：OV-225毛细管柱，柱温240℃，载气为氮气，流速30mL/min，氢气流速48mL/min，衰减6～7，样品与标样进样量均为2μL，根据保留时间与标样对比分析。
　　1.2.6 高碘酸氧化和Smith降解
　　SPG1多糖200mg溶于100mL 0.025 mol/LNa104中于暗处，12℃，间隔时间取样，稀释，在223nm测定高碘酸消耗量，将溶液中加入乙二醇放置10min，以终止反应，还原剩余的高碘酸，用溴甲酚紫为指示剂，用0.01mol/L，NaOH滴定甲酸释放量。
　　高碘酸氧化物经Smith降解得多糖醇，再经2mol/L硫酸于90℃水解8h，碳酸钡中和，离心，上清液减压浓缩，采用纸层析检查降解产物，展层剂为乙酸乙酯：吡啶：水(10：4：3)，显色剂为联苯胺，邻苯二甲酸，以葡萄糖、甘油、赤藓醇为对照。
　　1.2.7　13C核磁共振分析
　　少量SPG1溶于重蒸水，经AV400双通道全 数字化傅立叶超导核磁共振谱仪反应17h，检测温度298.7K，共振频率100.6MHz，累加次数32768次。
　　
　　2　结果与分析
　　
　　2，1理化性质
　　物理性质：SPG多糖为纯白色，冷冻干燥后呈蓬松海绵状，无臭无味，溶于水，易溶于热水，不溶于高浓度的乙醇、乙醚、丙酮、异丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。
　　化学性质：pH中性，蒽酮试剂反应呈蓝绿色，苯酚一硫酸试剂反应呈红色。
　　
　　2，2分离及纯化
　　通过对比分离效果，确定当选取SephdexG－200为填料，氯化钠溶液浓度为0.9％时为SPG多糖的最佳洗脱条件，从图1可看出裂褶多糖粗多糖洗脱后得到两个裂褶多糖组分，SPG1、SPG2，根据葡聚糖凝胶的洗脱规律，SPG1应为其中相对分子质量较大的组分，取SPG1进行研究，对SPG1进行了纯化，由图2可知只有一个洗脱曲线，因此SPG1为均一成分。
　　
　　2，3纯度分析及红外光谱分析
　　SPG1经190～400nm区间紫外扫描，仅在196nm处有多糖特征吸收峰(图3)，无核酸(260nm)、蛋白质(280nm)等杂质峰，
　　SPG1红外光谱分析结果(图4)表现出一般多糖类物质的特征吸收峰：3545em-1的宽峰是-OH键的伸缩振动峰，1623em-1左右有C-O非对称伸缩振动峰，1138em-1左右有O-H变角振动峰，669cm-1处的吸收峰为吡喃型β糖苷键的特征峰，由以上结果可以推断SPG1为一种β型吡喃多糖。
　　
　　2，4相对分子质量的测定
　　蓝葡聚糖与各标准葡聚糖的洗脱曲线见于图5，5个峰从左至右分别是蓝色葡聚糖、T500、170、T40和T10的洗脱曲线；同时，根据各洗脱体积绘制的标准曲线见于图6，根据SPG1的洗脱体积与标准曲线之间的关系，查得SPG13的相对分子质量约为436kDa。
　　
　　2.5单糖组分分析
　　对标准多糖进行了气相色谱(图7)测定，图中出现了5个峰，从左至右分别是鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，SPG。完全酸水解产物，经糖腈乙酰酯衍生化以后，GC分析结果(图8)仅出现一个组分峰，通过与标准单糖保留时间(图7)对比，确定该组分为葡萄糖，说明sPG1是由葡萄糖单一组分构成。
　　
　　2，6高碘酸氧化和Smith降解
　　SPG1多糖经高碘酸氧化完全后，测得每摩尔单糖消耗高碘酸0.56mol，同时释放甲酸0.26mo1，高碘酸的消耗量为甲酸生成量的2倍；Smith降解产物中只含有甘油和葡萄糖，说明有(1→6)糖苷键存在。
　　SPG1的核磁共振波谱如图9所示，糖环上不同位置的碳原子发生取代后，不管是二糖、寡糖及多糖，只要取代基的结构相同，其向低磁场化学位移也基本相似，另一个有用的原则是，糖环上发生取代的碳原子的化学位移有较大的变化，根据以上规律，获得图谱后，先考查相应范围的信号，以确定有没有取代发生。
　　根据其各化学位移与已知结构含有β(1-6)连接支链的β-(1.3)-D-葡聚糖如Lentinan、lami-naran等比较，并结合图谱中各峰的相对高度比可知：组成SPG1的重复单元应该含有3个主链糖基和一个单糖分支，主链的取代发生在c-1和C-3之间，即为l→3糖苷键；分支发生在C-1和C-6之间，即为1→6糖苷键，其中分支点在主链糖基的C-6上。
　　
　　3讨论
　　
　　本文采取活性炭脱色、Sevag法脱蛋白初步纯化、乙醇沉淀、柱层析分离等方法提取纯化SPG1多糖，取得了良好的效果，获得了相对分子质量约436kDa的高相对分子质量裂褶多糖，通过GC分析确定SPG1由葡萄糖单一组分构成；红外光谱、高碘酸氧化、Smith降解、13C-NMR分析基本确定其化学结构为带有β-(1.6)葡萄糖分支的β-(1-3)-D葡聚糖；G-200凝胶层析法测定其相对分子质量为436 kDa.SPG1的结构与多种具有增强免疫、抗肿瘤等生物活性的微生物β(1-3)-D葡聚糖相吻合，由此可预测，SPG1在医药领域具有广阔的应用前景。