最新十级伤残鉴定标准 [一个鼻咽癌相关ＥＳＴ的鉴定及其全长ｃＤＮＡ序列分析]

　　摘　要：鼻咽癌是我国南方及东南亚地区常见的恶性肿瘤之一。通过对鼻咽癌染色体高频率杂合性丢失区域3p21的表达序列标签(expressed sequencetag，EST)进行同源性比较分析，运用逆转录聚合酶链式反应的方法，筛选到一个在41．18％(14／34)的鼻咽癌活检组织及20．0％(1／5)的鼻咽癌细胞系中表达下调的ESTBC772301；并用Northern杂交方法，检测了该EST在多种正常成人组织中的表达状况及其所代表基因的转录本大小。在此基础上，对该EST来源的cDNA克隆(1MACE：4839190)进行直接测序，获得了一个全长为2377bp的新cDNA序列；经生物信息学分析，发现它与已知基因序列无明显同源性，属于一个新基因，定位于染色体3p21．3，被命名为鼻咽癌表达下调基因(NPCEDRC，GenBank登录号：AF538150)。其编码的蛋白质含169个氨基酸，与一个已报道的在进化上相对保守、功能未知的人类蛋白Nicolinl(简称NICNl)N端170个氨基酸残基的序列同源性为97％，但缺少NICNl蛋白C端43个氨基酸残基，可能是nicoUnl基因不同剪接本的编码产物。
　　关键词：鼻咽癌；表达序列标签：全长cDNA；序列分析
　　中圈分类号：R730
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847(2006)02―0172-06
　　鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方常见的一种恶性肿瘤。目前认为：NPC具有遗传易感性背景和复杂的遗传学改变，且与EB病毒感染和环境化学致癌因素相关，其发病遵循典型的多基因一环境交互作用模式。细胞及分子遗传学研究表明，NPC存在多个染色体部位如：3p、3q、9p、11q、12q、13q、14q和16q等非随机性的缺失或扩增，尤其是3p的缺失或称之为杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)在NPC发病过程中出现最早、发生频率最高。现已知NPC染色体3p发生高频率LOH的区域主要为3p12-14、3p21-22和3p25-26，这其中又以3p21-22最值得关注。因为除LOH研究外，利用微细胞介导的单染色体转移和融合细胞的裸鼠致瘤实验，已证实在染色体3p21．3可能存在一个与NPC相关的抑瘤基因(tumor suppressorgene，TSG)；而我所最近在CancerResearch发表的研究结果，也将3p21确定为一个与家族性NPC连锁的易感位点。按照Knudson的“二次突变”学说，上述资料为从染色体3p21区域克隆出在鼻咽癌变过程中起关键作用的TSG提供了有力的依据。
　　为此，我们利用现有数据库中的大量表达序列标签(expression sequencetag，EST)资源，从位于NPC高频率LOH区域3p21的EST着手，通过逆转录PCR(reverse transcription―polymerasechainreaction，RT-PCR)筛选，鉴定出一个在NPC活检组织和细胞系中均表达下调的ESTBG772301；在此基础上，我们运用Noahem杂交方法检测了该EST在多种正常成人组织中的表达情况及其所代表基因的转录本大小，并通过对该EST的cDNA克隆进行直接测序，获得了一个新的全长cDNA序列，命名为鼻咽癌表达下调基因(NPCEDRG)
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1．1 鼻咽癌组织及细胞系
　　收集成年人鼻咽慢性炎症组织16例(作为正常对照)和鼻咽癌活检组织34例(其中低分化鳞癌32例，中分化鳞癌1例，泡状核细胞癌1例)，所有组织标本均经病理确诊。鼻咽慢性炎症组织及鼻咽癌组织均取材于中南大学湘雅医院耳鼻喉科门诊活检标本。活检组织一分为二，一半用于病理诊断，一半迅速装入经DEPC处理与高温消毒的冻存管内，置入液氮中速冻保存备用。5株人鼻咽癌细胞系(HONEl、HNEl、HNE2、CNEl、CNE2)和1株白血病细胞系(HL-60)由本室提供及培养。
　　
　　1．2 总RNA提取
　　成人正常鼻咽组织和鼻咽癌组织总RNA抽提：碾钵中先加入液氮预冷，将组织从液氮中取出，迅速放人盛有少量液氮的碾钵内碾碎，再加入1 mL TRIzol试剂碾磨，其余按说明书操作。鼻咽癌细胞系总RNA抽提：Hanks’液洗涤2次，吸尽Hanks’液，加1mL TRIzol试剂振荡，其余按说明书操作。
　　1．3 RT-PCR
　　正常鼻咽组织、NPC活检组织及细胞系提取的总RNA，先用RNase-freeDNaseI(Roch公司)预处理，然后经苯酚、氯仿抽提，再按逆转录试剂盒(Promega公司)说明书进行逆转录。取逆转录产物1～2μL作为模板，进行PCR反应。PCR每管中同时加入内对照GAPDH和EST引物，总反应体系50μL，反应参数为：94℃变性4min；94℃50 s，58℃50s，72℃1min，30个循环，72℃延伸5min。PCR完毕后，取5℃LPCR产物点样于1．0％琼脂糖凝胶，电压50～80V，电泳20～40min，溴化乙啶染色并照相。
　　1．4 探针制备与Northern杂交
　　探针制备：通过电泳回收、纯化ESTBG772301和GAPDH的PCR产物，经测序证实无误后，以之作为模板，采用α-32p-dCTP(北京亚辉公司)和随机引物标记试剂盒(Promega公司)制备同位素标记探针，操作方法按照试剂盒使用手册。Northern杂交：采用上述同位素标记的探针，对Clontech公司的MTNTM Blot膜(目录号：7760－1，含8种正常成人组织总RNA)进行杂交，杂交程序及操作方法参见使用说明书，杂交膜于－70℃放射自显影3～7d后洗片。通过MTNTMBlot膜的杂交，可显示ESTBG772301所代表基因的转录本大小及其在不同组织中的表达丰度。
　　1．5 全长cDNA序列的获得和生物信息学分析
　　通过EST数据库查寻，已知一个来源于I．M．A．C．E．Consortium的cDNA质粒克隆(1MAGE：4839190)包含ESTBG772301。从Re－searchGenetics公司购买该cDNA质粒克隆，用质粒纯化试剂盒(Qiagen公司)抽提质粒DNA，送上海博亚生物技术公司进行测序，测序结果用DNASTAR序列分析软件包进行拼接，获得全长cDNA序列。cDNA序列及其编码蛋白的氨基酸序列，通过因特网(Internet)上的核酸数据库(http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/GenBank)和蛋白质数据库(http：//www．expasy．ch)及其分析程 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 序，进行生物信息学分析。
　　
　　2 结果
　　
　　2．1 EST的筛选
　　进入美国国家生物技术信息中心(NCBl)网站，首先在EST数据库(http：//WWW．ncbi．nlm．nih．gov/dbEST/index．html)输入3号染色体区带信息，找到几十条EST，然后在Genemap(http：//WWW．ncbi．nlm．nih．gov/genemap/map．cgi)直接点击3号染色体相应区带，查找到几百条EST。对查找到的所有ESTs利用blastn程序(http：//WWW．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST)进行同源性比较、分析，剔除代表已克隆基因的EST和来源于同一族的EST。我们选择EST的标准是：1)与已知基因同源性小于50％，代表未克隆基因；2)序列长度大于400bp；3)尽可能地来源于染色体3p21区域，并有关于染色体定位信息的说明；4)序列中不含Alu重复序列。据此，我们筛选到46个满足以上条件的EST，选取20个EST进行RT-PCR扩增，对表达下调的EST用PCR产物标记探针，然后进行Northern杂交。
　　2．2 RT-PCR检测结果
　　对EST的部分RT-PCR检测结果见图1。结果表明，ESTBG772301在41．18％(14／34例)的鼻咽癌组织和20．0％(1／5株)的鼻咽癌细胞系中mR―NA的表达水平低于成人正常鼻咽组织。此外，在1例白血病细胞系(HL-60)中也明显表达下调。
　　
　　2．3 Northern杂交结果
　　用EST BG772301和GAPDH的PCR产物标记探针，对MTNTMBlot人多种正常组织RNA膜进行杂交，结果发现：ESTBG772301在人多种正常组织中都有表达，相对而言，人胎盘、肺及肝组织中阳性杂交信号较弱，而人心、脑、骨骼肌、肾及胰腺组织均有较强的阳性杂交信号，说明ESTBG772301所代表的基因较为保守。另外，结果还显示该基因的转录本大小约为2．4kb左右，而内对照GAPDH在人多种正常组织中的阳性杂交信号无强弱的差别，表明各泳道RNA量基本一致(图2)。
　　
　　2．4 全长cDNA克隆测序和生物信息学分析
　　我们通过对cDNA质粒克隆(IMAGE：4839190)测序，获得了一个全长为2 377 bp的cDNA序列，与Northern杂交检测到一个大小为2．4kb转录本的结果基本相符。该cDNA序列含507bp开放阅读框(ORF)，编码169个氨基酸，起始密码子ATG位于第43位核苷酸，终止密码子TAA位于第549位核苷酸，终止密码子后有加尾信号及polyA尾(图3)。经blastn程序(http：//WWW．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST/)对非冗余(nr)数据库进行核酸序列同源性比较分析，发现该cDNA序列与已知基因序列比较无显著性相似，属于一个新的基因。征得人类基因组组织(HUGO)同意，将该基因命名为鼻咽癌表达下调基因(NPCEDRG)，Genbank登录号：AF538150。与人基因组序列进行BLAST分析(http：//www.ncbknlm．nih．gov/genome/seq/Hsblast．html)，发现该基因cDNA序列与人类3号染色体大规模测序构建的重叠群(contig)序列NT―022439的同源性高达98％-100％，序列NT―022439完全覆盖了NPCEDRG的cDNA序列，从而将NPCEDRG精确定位于染色体3p21．3；同时，还发现NPCE-DRG的基因组DNA长约6．3 kb，由6个外显子和5个内含子组成．经blastp程序(http：//WWW．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST/)进行蛋白质序列同源性比较，发现该基因编码的蛋白质与一个已报道的在进化上相对保守、功能未知的人类蛋白Nicolinl(简称NICNl)N端170个氨基酸残基的序列同源性达97％，但缺少NICNl蛋白C端43个氨基酸残基，可能是nicolinl基因不同剪接本的编码产物。对该基因编码蛋白的理化特征、结构、功能进行预测分析(http：//www．expasy．ch)，发现该基因编码蛋白的计算等电点为8．3，相对分子质量约为19．2kDa，属于亲水性蛋白，富含亮氨酸和脯氨酸，含有两个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点，一个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。
　　
　　3　结果
　　
　　大量研究表明，鼻咽癌(NPC)染色体3p21区域常常发生高频率的非随机性杂合性丢失(LOH)。而且，通过微细胞介导单染色体转移的功能性研究也已证实，染色体3p21．3位点可能存在与NPC相关的抑瘤基因(TSG)。因此，3p21成为我们克隆NPC相关基因的首选染色体区域。但人染色体3p21区域内，仅3p21．3位点就跨越了20cM(centimorgan，cM)，相当于200Mb，如何在这么大的范围内克隆和鉴定NPC相关基因是我们面临的一个难题。
　　表达序列标签(EST)是cDNA克隆的5＇或3＇端已测定序列，它几乎覆盖了所有的人类基因(尤其是未知基因)，并代表了基因的转录水平。EST的大规模测序是人类基因组计划(HGP)构建转录图谱的重要组成部分，随着人类基因转录图谱中EST在数目上的迅猛递增及其在染色体上的精确定位，EST已成为定位克隆人类新基因(包括未知抑瘤基因)的重要手段。本研究正是采用这一策略，从NPC高频率LOH区域3p21的EST人手，首先通过RT-PCR筛选，鉴定出一个ESTBG772301在NPC组织及细胞系中均表达下调，然后对该EST进行全长cDNA序列分析，从而克隆到一个新的NPC相关基因。
　　
　　在鉴定出一个有意义的EST之后，获取该EST所代表基因的全长cDNA序列就成为进一步研究的关键。已知的方法有多种，如利用该EST序列作探针来筛选cDNA文库，或对该EST序列进行5＇和3＇cDNA末端快速扩增(RACE)等，但这些方法均较为费时、费力。由于EST本身来源于eDNA克隆的大规模测序，大多数的EST都有其对应的cDNA克隆，而这些克隆中有些已包含有全长的eDNA序列，因此在能获得EST相应eDNA克隆的前提下，对EST来源的cDNA克隆进行直接测序，不失为一种简便地获取基因全长eDNA序列的方法。
　　对测序获得的一个cDNA序列，判断它是否为全长，可以借助生物信息学方法进行分析：5＇端，可根据在开放阅读框架(ORF)的第一个ATG上游有无同框架的终止密码子，无终止密码子的则考虑是否有保守的Kozak序列来进行判断；3＇端，可根据编码框架的下游有无终止密码子或polyA加尾信号来判断，无明显加尾信号的则看是否有polyA尾。当然，生物信息学分析的结果也要通过实验验证，如用Northern杂交证实mRNA大小，用逆转录产物或在eDNA文库中进行PCR扩增，确定连续、完整的cDNA全长序列等。
　　本研究所克隆的新的NPC相关基因，正是在筛选到一个在鼻咽癌中表达下调的ESTBG772301的基础上，通过对ESTBG772301对应的eDNA克隆(1MAGE：4839190)进行直接测序，获取了基因全长约2 377bp的cDNA序列。这与用ESTPCR产物作为探针，对MTNTM Blot人多种正常组织RNA膜进行Northern杂交，检测到2．4kb转录本的结果是基本一致的。对该序列的生物信息学分析发现，其含有一个507bp的开放阅读框(ORF)，起始密码子ATG位于第43至45位核苷酸，符合Kozak序列特点；终止密码子TAA位于第552至554位核苷酸，终止密码子后有加尾信号及poly(A)尾。因此，我们认为该序列代表了一个基因的完整eDNA序列，而且BLAST分析表明其与已知基因序列无明显同源性，属于一个未被克隆的人类新基因，经人类基因组组织(HUGO)同意，将它命名为鼻咽癌表达下调基因(NPCEDRG)。由于该eDNA序列能被人类3号染色体大规模测序构建的重叠群(contig)序列NT―022439完全覆盖，因而将其精确定位于染色体3p21．3，并由此分析得知该基因的结构：基因组DNA长约6．3 kb，由6个外显子和5个内含子组成。该基因编码的蛋白质由169个氨基酸组成，理论等电点为8．3，计算相对分子质量约为19．2kDa，属于亲水性蛋白，富含亮氨酸和脯氨酸，含有两个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点，一个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，其与一个已报道的在进化上相对保守、功能未知的人类蛋白Nieolinl(简称NICNl)N端170个氨基酸残基序列高度同源(序列同源性高达97％)，但缺少NICNl蛋白C端43个氨基酸残基，可能是nicolinl基因不同剪接本的编码产物。目前，对该基因的生物学特性和在鼻咽癌发生发展中的作用及其分子机制，我们正在深入研究中。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文