质粒的诱导 ＣＹＰ３Ａ４基因原核表达质粒构建与诱导表达

　　摘 要：以质粒pCWNF14为模板，采用PCR技术扩增出CYP3A4基因，并将其接入pET-22b(+)、pET－28b(+)和pET－32a(+)载体中，经PCR测序鉴定后，转化Rosetta(DE3)2pLysS细菌，并用IPTG诱导表达，采用考马斯亮蓝染色的方法检测重组蛋白表达，3个表达重组质粒中，只有pET－32a(+)－CYP3A4可以表达目的蛋白；在低浓度IPTG(50μmol/L)诱导6h，所表达的CYP3A4蛋白约占细菌总蛋白的40％，且该蛋白不溶于8mol/L的尿素，而溶于去污剂10mmol/L 3－((3－cholamidopropyl)dimethylammonio propanesulfonic acid(CHAPS))和0.3％lauroyl sarcosine(SKL)，成功地使CYP3A4基因在原核系统中高效表达。
　　关键词：CYP3A4；大肠肝菌；表达
　　中图分类号：Q75
　　文献标识码：A
　　文章编号：1007．7847(2007)01.0028-05
　　
　　CYP450蛋白是一类含血红素酶，它负责催化多种外源、内源性化合物的生物转化，例如：药物、致癌物等[1，2]，临床上大多数药物都需经CYP450代谢，所以一些候选药物在临床前需经CYP450代谢检测，尤其是近年来，新药的不断出现以及两种或两种以上药物同时应用对疗效的影响越来越受到重视，迫切需要应用体外系统能够快速、高通量检测对CYP450酶活性的影响，因此重组蛋白CYP450在药物代谢研究中具有重要的价值，CYP3A4是CYP450基因家族中一个重要的酶，它主要分布于肝脏、小肠，它涉及了许多药物的代谢过程，所以该蛋白异源性表达一直是研究的热点，本研究采用pET-32a(+)载体和Rosetta(DE3)2pLysS细菌建立了快速、高效表达CYP3A4的方法。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 主要试剂
　　大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)2 pLysS、XL-1为本室保存菌种；含有CYP3A4基因的质粒pCWNF14由Pro.Guengerich F惠赠，载体pET-22b(+)、pET-28b(+)和pET-32a(+)购自Merck公司(美国)；限制性内切酶BamH I、Xho I、Bgl，T4DNA连接酶购自NEB公司(英国)；高保真Taq酶pfu购自Promega公司(美国)；胰化蛋白胨、酵母提取物为Oxoid公司(美国)；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、IPTG(异丙基-β－D－硫代半乳糖苷)等购自Sigma公司(美国)；其它试剂为国产分析纯试剂。
　　
　　1.2 引物设计与合成
　　根据CYP3A4基因的序列设计引物，cyp3a4sense：5′CC GGATCCG ATGGCTCTGTFATT AGCAGTTTTTCTGGTGCTCCTC 3’，eyp3a4anti：5′TG CTCGAG TGCTCCACTTACGGTG CCA，由上海博亚公司合成，其中GGATCC与CTCGAG为BamH I和Xho I的酶切位点，前面的碱基为保护序列。
　　
　　1.3 CYP3A4基因扩增及克隆
　　取10ng pCWNF14质粒为模板，加入20μmol/L引物2.5μL，5ixL10×buffer，10mmol/LdNTP1μL，5U/μLpfu0.5μL，H2O 39 μL.PCR扩增条件为94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30循环；72℃5 min.PCR产物经BamH I和Xho I酶切，切胶纯化基因片段，载体pET-22b(+)和pET-28b(+)经BamH I和Xho I酶切，而pET-32a(+)经Bgl和Xho I酶切，纯化载体酶切产物与CYP3A4基因片段连接，转化XL-1细菌，挑取菌落进行鉴定，并提取质粒测序。
　　
　　1.4 CYP3A4基因诱导表达
　　重组子pET-22b(+)-CYP3A4、pET-28b(+)-CYP3A4和pET-32a(+)-CYP3A4转化Rosetta(DE3)2pLysS，挑取单个菌落，接种于3 mL含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中培养过夜，取过夜培养物1mL接种于含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中培养2h，测定OD600值，约O.6h加入IPTG，终浓度为50μmol/L，继续培养，分别于3、6h取1mL菌液，以未加IPTG诱导的各重组子细菌培养物为对照，重组子pET-28b(+)－CYP3A4采用的培养基所含的为卡那霉素(50mg/L)。
　　
　　1.5 重组蛋白检测
　　将细菌培养物1mL离心收集细菌，用TE重悬细菌，并加适当的蛋白上样缓冲液，煮沸5min后进行SDS-PAGE电泳，并经考马斯亮蓝染色，确定蛋白有无表达。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 CYP3A4基因克隆至表达载体
　　将扩增的CYP3A4基因片段与表达载体酶切，连接后转化XL-1细菌，挑取克隆用PCR方法鉴定。提取质粒，应用T7启动子、T7终止子为引物，测序结果证实克隆到了全长的CYP3A4基因，且无任何的碱基突变，测序结果如图1所示(所用的为T7启动子引物，以pET-28b(+)-CYP3A4为例，余未列出)，所构建的质粒如图2所示，以pET-32a(+)－CYP3A4为例。
　　
　　
　　2.2 CYP3A4基因诱导表达
　　将重组子转化Rosetta(DE3)2pLysS细菌，以低浓度(50 μmol/L)IPTG进行诱导，分别于3、6h后取1 mL菌液进行检测，重组子pET-22b(+)－CYP3A4、pET-28b(+)，CYP3A4，在诱导3、6h后，未见有特异性的蛋白表达(图3)，即使以高浓度0.8mmol/L的IPTG诱导，也未见蛋白表达(结果未列出)；而pET-32a(+)-CYP3A4重组子，在低浓度IPTG50μmol/L下，在相对分子质量60kD处有一特异性带出现，与预期CYP3A4重组蛋白相对分子质量相符，且随着诱导时间的增加，蛋白表达量增加，于诱导6h后，约占总蛋白量的40％左右(图4)。
　　
　　
　　
　　2.3 CYP3A4蛋白溶解
　　将细菌超声后，提取上清，离心取沉淀用8mol/L尿互素溶解沉淀，再次取上清，将沉淀用0.3％SKL溶解，将这些产物上样电泳；同时将细菌用10mmol/L CHAPS重悬，所得上清和沉淀也上样电泳，最后用考马斯亮蓝染色，结果如图5所 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 示，在上清中只有少量的目的蛋白(Lane 3)，沉淀物用8mol/L尿素，不能将其溶解(Lane 6)，而可以被SKL溶解(Lane 7)；用10mmol/L CHAPS重悬细菌后，发现大部分目的蛋白在上清中(Lane4)，而沉淀里很少(Lane 5)。
　　
　　3 讨论
　　
　　CYP450系统是机体对内、外源性物质，尤其是药物进行生物转化的重要酶系，CYP450是一个超家族，目前已经确定的，人类CYP450分属于18个家族，42个亚家族，在人体药物代谢过程中，主要有3个家族，CYPI、CYP2和CYP3，在CYP3家族中，CYP3A4含量最丰富，约占CYP450酶系的30％－40％，同时也是参与临床药物代谢主要的酶，据估计约50％的药物经过该酶的生物转化作用。
　　在临床药物治疗过程中，经常会出现两种或两种以上药物同时或先后应用，使得药物作用效果增强或减弱的现象，其主要原因就在于引起CYP450酶活性的诱导和抑制，为了更好地进行临床配伍用药，达到良好的治疗效果，目前一些公司开发出一些进行体外检测药物相互作用的荧光探针的方法，在检测系统中，一个主要的酶就是CYP3A4.CYP3A4的异源表达系统主要有酵母、昆虫、细菌等，但酵母和昆虫系统纯化繁琐，所涉及的成本较高，而原核系统在这一方面具有明显的优点，曾有报道CYP3A4很难在原核系统中表达一些研究者将CYP3A4基因5’端进行修饰(缺失碱基或置换密码)，或与一些分子伴侣共表达，或在5’端加入细菌所识别的信号肽，以及改良培养基，使得该CYP3A4能够在细菌中表达，但大多需长时间(24-72h)或低温诱导表达，且表达量并不高。
　　本研究的目的是提高CYP3A4的表达，采用Rosetta(DE3)2pLysS做为表达菌，该细菌含有真核蛋白所涉及一些稀有密码子，同时该细菌可以表达少量的T7溶菌酶，此酶为T7RNA聚合酶的抑制物，有助于目的蛋白的表达调控，在本研究中采用了3种载体，pET-28b(+)载体对目的蛋白修饰最少；pET-22b(+)具有pelB信号，该信号肽有助于目的蛋白分泌到周间质中，这两个载体，改变温度和／或调节ITPG浓度，用考马斯亮蓝的方法都检测不出有特异性的蛋白表达，文献报道pelB信号肽可以增加蛋白表达，但表达量也较少，每升培养基可以表达100nmol重组蛋白，pET-32a(+)载体具有trxA标签，该标签有助蛋白的可溶性表达，在实验中，即使以低浓度的IPTG诱导6h。即可使蛋白高效表达，占细菌总蛋白的40％左右。估计1L培养基表达目的蛋白可以达100mg左右，作者曾将重组子转化BL21(DE3)细菌，3个重组子都未检测到蛋白的表达(结果未列出)，提示Rosetta(DE3)2pLysS细菌所提供的稀有密码子对CYP3A4的表达有重要意义。
　　对细菌所表达的目的蛋白进行粗提，当超声后，上清中的蛋白较少；沉淀不溶于8mol/L的尿素，而溶于0.3％的SKL；采用10mmol/L的CHAPS溶解细菌，发现CYP3A4蛋白主要在上清中。SKL和CHAPS是去污剂，是提取膜蛋白较好的试剂，提示采用pET-32a(+)表达CYP3A4蛋白可能的表达形式为膜蛋白形式。
　　本研究对CYP3A4蛋白在原核系统表达进行了摸索，为下一步将进行在此系统中提高蛋白的酶活性研究打下了基础，也为药物研究也减少成本带来希望。
　　
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