【褐鳞环柄菇发酵液对桃红颈天牛初龄幼虫的毒性反应】 褐鳞环柄菇

　　摘要：为研究褐鳞环柄菇用于防治桃红颈天牛，用褐鳞环柄菇发酵菌液对桃红颈天牛初龄幼虫进行毒杀试验，处理３ ｄ后桃红颈天牛初龄幼虫的死亡率为７１．６７％；发酵菌液经超声波破碎离心提取上清液，分别配置成体积分数５％、１０％、１５％、２０％的稀释液，对桃红颈天牛初龄幼虫进行毒杀试验，当上清液体积分数达到１５％以上时毒杀作用明显，桃红颈天牛初龄幼虫死亡率达到８０．００％以上，与１０％的处理存在极显著差异；上清液进行不同温度处理、ｐＨ值调节、有机溶剂添加后，对桃红颈天牛初龄幼虫的杀虫活性最高的处理分别是温度２０ ℃、ｐＨ值７.0、有机溶剂９５％乙醇。
　　关键词：桃红颈天牛；褐鳞环柄菇；毒性反应；发酵菌液
　　中图分类号：Ｓ４３６．６２１．２＋９；Ｓ４８２．３＋９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）12－2446-03
　　
　　Toxic Reaction of Zymotic Liquid of Lepiota helveola on Early Instar Larvae
　　of Aromia bungii
　　
　　ＨＯＮＧ Ｎａ，ＹＡＮＧ Ｓｈａｏ－ｂｉｎ
　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１００４４，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｒｅ effect ｏｆ Ｌｅｐｉｏｔａ ｈｅｌｖｅｏｌａ Ｂｒｅｓ． oｎ Ａｒｏｍｉａ ｂｕｎｇｉｉ（Ｆａｌｄｅｒｍａｎｎ）， ｚｙｍｏｔｉｃ ｌｉｑｕｉｄ ｏｆ Ｌ. ｈｅｌｖｅｏｌａ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｉｎｓｔａｒ ｌａｒｖａｅ of Ａ. ｂｕｎｇｉｉ． Ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗａｓ ７１．６７% ３ ｄａｙｓ ｌａｔｅｒ． Ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂｒｅａｋｉｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ was ｍａｄｅ ｉｎｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｌｕｅｎｔ， ５%， １０%， １５%， ａｎｄ ２０%， ｔｈｅｎ ｔｅｘｔｅｄ ｏｎ Ａｒｏｍｉａ ｂｕｎｇｉｉ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｗａｓ ａｂｏｖｅ １５％， ｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ were ｏｂｖｉｏｕｓ． Ｔｈｅ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｉｎｓｔａｒ ｌａｒｖａｅ ｏｆ Ａｒｏｍｉａ ｂｕｎｇｉｉ ｗｅｎｔ ｔｏ ８０.00％ ａｎｄ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ higher than that of ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔｅ ｏｆ １０％ ｄｉｌｕｅｎｔ． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｉｎｓｔａｒ ｌａｒｖａｅ ｏｆ Ａｒｏｍｉａ ｂｕｎｇｉｉ ｗｅｒｅ ２０ ℃， ｐＨ ７．０， ａｎｄ ９５％ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｒｏｍｉａ ｂｕｎｇｉｉ（Ｆａｌｄｅｒｍａｎｎ）； Ｌｅｐｉｏｔａ ｈｅｌｖｅｏｌａ Ｂｒｅｓ．； ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ； ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｌｉｑｕｉｄ
　　
　　桃红颈天牛（Ａｒｏｍｉａ ｂｕｎｇｉｉ）属于鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）天牛科（Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅ）害虫。其幼虫危害果树林木，在树体皮层和木质部钻蛀隧道，影响水分和养分的输送，常造成树干中空，皮层脱离，致使树势衰弱、降低产量，严重者可致树体死亡、果园绝产。其食性较杂，寄主包括桃、板栗、花椒、石榴、桑等［１－４］，对我国各核果类果树栽培区均已造成危害，特别对盛果期的成年果树危害尤为严重［５］。
　　有毒大型真菌分布广泛，其中一些可产生对昆虫有明显的抑制或毒性作用的活性物质，这些活性物质可利用于农林业对植物害虫的生物防治，具有重要的经济价值［６］。 褐鳞环柄菇（Ｌｅｐｉｏｔａ ｈｅｌｖｅｏｌａ Ｂｒｅｓ．）属伞菌目（Ａｇａｒｉｃａｌｅｓ）蘑菇科（Ａｇａｒｉｃａｃｅａｅ）环柄菇属（Ｌｅｐｉｏｔａ）真菌，分布范围广，含有毒肽类毒素，具有较大毒性［７］。试验选用其发酵菌液及发酵菌液经超声波处理后离心分离的上清液，研究其对蛀干性害虫桃红颈天牛的毒性作用，为开发利用菌物新资源提供参考。
　　１材料和方法
　　１．１试验材料
　　１．１．１试验昆虫桃红颈天牛幼虫为实验室饲养的成虫后代，选用刚孵化的正常初龄幼虫。
　　１．１．２试验菌褐鳞环柄菇菌种由沈阳大学微生物实验室提供。
　　１．１．３褐鳞环柄菇发酵菌液在２５０ ｍＬ三角瓶中装入不加琼脂的改良ＰＤＡ培养基１００ ｍＬ，用移液管加入无菌水５ ｍＬ于纯化好的真菌斜面并用接种针刮取菌丝体制成菌悬液，将菌悬液倒入装有液体培养基的三角瓶中，摇床发酵。摇床温度２６ ℃、转速１１０ ｒ／ｍｉｎ，发酵时间７ ｄ，成褐鳞环柄菇发酵菌液。
　　１．１．４褐鳞环柄菇上清液将褐鳞环柄菇发酵菌液用ＪＹ９９―２Ｄ超声波细胞粉碎机（功率２００ Ｗ，工作／间歇１ ｓ／１ ｓ，２０ ｍｉｎ）破碎，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ冷冻离心得上清液。
　　１．１．５木屑新鲜京桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ ｆ． ｒｕｂｒｏ－ｐｌｅｎａ）树枝经微型植物试样粉碎机粉碎后，过３０目筛。
　　１．２试验方法
　　１．２．１褐鳞环柄菇发酵菌液对桃红颈天牛幼虫的毒杀试验称取５ ｇ木屑、１ ｍＬ褐鳞环柄菇发酵菌液混匀后平铺于培养皿中。取２０头桃红颈天牛初龄幼虫置于培养皿中。试验设３个重复。以清水代替发酵菌液作相同处理为对照。培养皿置阴暗处３ ｄ后观察，记录毒杀情况，计算死亡率。
　　１．２．２褐鳞环柄菇上清液对桃红颈天牛幼虫的毒杀试验将上清液用无菌水稀释成体积分数（上清液／稀释液）分别为Ａ１ ５％、Ａ２ １０％、Ａ３ １５％、Ａ４ ２０％的溶液。按１．２．１的方法分别用Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４进行桃红颈天牛初龄幼虫的毒杀试验。空白对照（Ａ０）以清水替代上清液稀释液。３ ｄ后观察，记录毒杀情况，分析数据。
　　１．２．３不同温度处理对褐鳞环柄菇上清液杀虫活性的影响褐鳞环柄菇上清液１０ ｍＬ经０、２０、４０、６０、８０、１００和１２１ ℃各处理３０ ｍｉｎ，测定不同温度处理后的上清液杀虫活性变化。其中，１２１ ℃处理为高压灭菌锅内温度稳定２０ ｍｉｎ，０ ℃为冰水混合物水浴３０ ｍｉｎ，２０、４０、６０、８０、１００ ℃为同温水浴３０ ｍｉｎ，然后按１．２．１的方法分别用处理后的上清液进行试验。３ ｄ后观察毒杀情况，分析数据。
　　１．２．４酸碱度对褐鳞环柄菇上清液杀虫活性的影响将褐鳞环柄菇上清液１０ ｍＬ分别用ＨＣｌ或ＮａＯＨ调ｐＨ值至３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０和１１．０。然后按１．２．１的方法分别用不同ｐＨ值的上清液进行天牛初龄幼虫的毒杀试验。３ ｄ后观察毒杀情况，分析数据。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　１．２．５有机溶剂对褐鳞环柄菇上清液杀虫活性的影响在３０ ｍＬ上清液中分别加入等体积的无水甲醇、９５％乙醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮，室温下自然挥发至３０ ｍＬ，然后按１．２．１的方法分别用不同有机溶剂处理后的上清液进行天牛初龄幼虫的毒杀试验。分别用相应溶剂３０ ｍＬ加等体积清水后自然挥发至３０ ｍＬ的混合液处理木屑作为对照。３ ｄ后检查毒杀情况，分析数据。
　　１．３数据处理
　　死亡率＝×１００％
　　采用ＳＰＳＳ１３．０软件对试验数据进行分析。
　　２结果与分析
　　２．１褐鳞环柄菇发酵菌液对桃红颈天牛初龄幼虫的毒杀效果
　　从试验结果（表１）可见，褐鳞环柄菇发酵菌液对桃红颈天牛初龄幼虫毒杀效果明显，３ ｄ后的幼虫死亡率为７１．６７％，远高于对照。
　　２．２褐鳞环柄菇上清液对桃红颈天牛初龄幼虫的毒杀效果
　　从褐鳞环柄菇上清液在不同稀释倍数下对桃红颈天牛初龄幼虫的致死情况（表２）可以看出，随处理中所用褐鳞环柄菇提取液体积分数的增加，桃红颈天牛初龄幼虫死亡率上升。
　　２．３处理温度对褐鳞环柄菇上清液活性的影响
　　从试验结果（表３）可以看出，经不同温度处理后，褐鳞环柄菇上清液对桃红颈天牛初龄幼虫的杀虫效果明显不同。２０ ℃处理后褐鳞环柄菇上清液杀虫活性最大，桃红颈天牛初龄幼虫的死亡率为８５．００％。随着处理温度的升高或降低，桃红颈天牛初龄幼虫死亡率明显下降，其中，４０、６０、８０、１００ ℃处理之间存在极显著差异。原因可能是随着温度升高，上清液中褐鳞环柄菇细胞破碎更充分，胞内物质释放得更彻底；但温度超过４０ ℃，褐鳞环柄菇所释放得有毒物质会随处理温度的升高而导致受破坏程度加剧，最终上清液中有毒物质含量降低，试验所得桃红颈天牛初龄幼虫死亡率明显下降。可见上清液最适处理温度为２０ ℃左右。
　　２．４酸碱度对褐鳞环柄菇上清液活性的影响
　　从试验结果（表４）可以看出，褐鳞环柄菇上清液ｐＨ值为７.0时，桃红颈天牛初龄幼虫死亡率最高，达８５．００％。上清液酸性或碱性增强，桃红颈天牛初龄幼虫死亡率都快速降低，多数相邻ｐＨ值之间的幼虫死亡率存在极显著差异。ｐＨ值为７.0时，褐鳞环柄菇上清液表现出对桃红颈天牛初龄幼虫的最高杀虫活性；而ｐＨ值达到３．0或高于１０．０，桃红颈天牛初龄幼虫的死亡率均和对照相接近，可见酸碱度对褐鳞环柄菇上清液杀虫活性有较大影响。原因可能为上清液中表现出杀虫活性的毒素为毒肽等蛋白多肽类物质，这些蛋白多肽类物质在酸性和碱性环境下容易被破坏，故在不同ｐＨ值环境下，上清液的杀虫活性明显不同。
　　２．５不同有机溶剂对褐鳞环柄菇上清液活性的影响
　　从试验结果（表５）可以看出，经有机溶剂处理，褐鳞环柄菇上清液仍有较强杀虫活性，其中以添加过９５％乙醇的上清液所致桃红颈天牛初龄幼虫死亡率最高，达９１．６７％，与加入乙醚、乙酸乙酯、丙酮的上清液处理的幼虫死亡率差异极显著。与溶剂＋清水处理相比，各处理桃红颈天牛初龄幼虫的死亡率均呈极显著差异。所选有机溶剂使上清液的毒性增加，原因可能是经有机溶剂处理后，上清液中的多肽类毒素溶于有机相中，增加了可溶性毒素含量。９５％乙醇处理后的上清液杀虫活性最强，但与无水甲醇处理相比差异不显著，如考虑甲醇对人体和环境的不良影响远大于乙醇，所以在几种有机溶剂中以９５％乙醇作为上清液的处理剂最为适宜。
　　３讨论
　　以大型真菌为材料制备杀虫剂的相关研究越来越受到国内外研究者的重视，在较多大型真菌中发现了具明显杀虫活性的物质。Ｋｕｂｏ等［８］发现毒蘑菇（Ｃｌｉｔｏｃｙｂｅ ｉｎｖｅｒｓａ）对果蝇和粘虫有较强的毒性；担子菌侧耳属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）［９］和鸡油菌（Ｃａｎｔｈａｒｅｌｌｕｓ ｃｉｂａｒｉｕｓ）［１０］中的部分种具有杀线虫活性物质；肉座菌科菌寄生菌属真菌（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）在红外光线照射下对松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）有明显的毒杀活性［１１］；蛹虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）是虫草属真菌中寄主范围较广的一个种，它对幼蚊有毒杀作用［１２］。
　　目前在桃红颈天牛的防治中主要使用化学杀虫剂，这些杀虫剂会产生药物残留问题，也可引起桃红颈天牛抗药性增强。大型有毒真菌毒素存在于自然界中，用以防治桃红颈天牛，可实现毒杀效率和无残留、无公害兼顾。大型有毒真菌资源丰富，种类繁多，通过液体深层发酵可获得大量的杀虫活性物质，利用其开发和生产杀虫剂具有良好的应用前景。试验可见，褐鳞环柄菇发酵液对桃红颈天牛幼虫的毒杀效果突出，尤其在上清液体积分数达到１５％以上时，初龄幼虫死亡率达到８０．００％以上。
　　参考文献：
　　［１］ 汤才，袁荣兰，虞国跃，等．浙江省板栗害虫种类及其危害状况调查［Ｊ］．浙江林学院学报，１９8８，５（２）：２２２－２３５．
　　［２］ 马玉敏，孙海伟，藤兴哲，等．花椒害虫种类调查［Ｊ］．河北林业科技，２００１（６）：２３－２４，２６．
　　［３］ 王道勋，娄志，李萍，等．怀远地区石榴主要病虫害的综合防治［Ｊ］．中国果树，２００２（１）：３６－３８．
　　［４］ 张建强，吴开明，许恩远，等．四川涪陵地区桑树病虫名录［Ｊ］．蚕学通讯，１９９５（３）：１６－２２．
　　［５］ 王景涛，孙立�，刘铁铮，等． 桃红颈天牛发生特点及防治措施研究［Ｊ］．河北农业科学，２００７，11（２），４１－４３，７９．
　　［６］ 高锦明，陈安良． 高等真菌杀虫成分研究进展［Ｊ］．西北林学院学报，２００２，１７（２）：６４－６８．
　　［７］ 卯晓岚．中国大型真菌［Ｍ］．郑州：河南科学技术出版社，２００４．
　　［８］ ＫＵＢＯ Ｉ，ＫＩＭ Ｍ， ＷＯＯＤ Ｗ Ｆ，ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｔｏｃｉｎｅ， ａ ｎｅｗ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｃｌｉｔｏｃｙｂｅ ｉｎｖｅｒｓａ ［Ｊ］． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９８６，２７：４２７７－４２８０．
　　［９］ ＫＷＯＲＫ Ｏ Ｃ Ｈ ， ＰＬＡＴＴＮＥＲ Ｒ， ＷＥＩＳＬＥＤＥＲ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｅｍａｔｉｃｉｄａｌ ｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ ＮＲＲＬ ３５２６ ［Ｊ］． Ｊ Ｃｈｅｍ Ｅｃｏｌ，１９９２，１８：１２７－１３６．
　　［１０］ Ｓｔａｄｌｅｒ Ｍ， Ｍａｙｅｒ Ａ， Ａｎｋｅ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｉｔｈ ｎｅｍａｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ，１９９４，６０：１２８－１３２．
　　［１１］ 董锦艳，张克勤，赵智娴，等．北醌类化合物的杀线虫活性［Ｊ］．菌物系统，２００１，２０（４）：５１５－５１９．
　　［１２］ 梁宗琪．虫生真菌的多样性［Ｊ］．生物多样性，１９９６，４（４）：２３５－２４１．
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文